DELLA-proteiinit ovat säilyneetkasvunsäätelijätjoilla on keskeinen rooli kasvien kehityksessä vasteena sisäisiin ja ulkoisiin signaaleihin. Transkriptionaalisten säätelijöiden ominaisuudessa DELLA-proteiinit sitoutuvat transkriptiotekijöihin (TF) ja histoni H2A:han GRAS-domeeniensa kautta ja ne rekrytoidaan vaikuttamaan promoottoreihin. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että DELLA-proteiinien stabiilisuutta säädellään translaation jälkeen kahdella mekanismilla: kasvihormonin indusoimalla polyubikitinaatiollagibberelliini, mikä johtaa niiden nopeaan hajoamiseen, ja konjugoitumiseen pienen ubikitiinimäisen modifioijan (SUMO) kanssa, mikä lisää niiden kertymistä. Lisäksi DELLA-aktiivisuutta säätelevät dynaamisesti kaksi erillistä glykosylaatiomekanismia: O-fukosylaatio tehostaa DELLA-TF-vuorovaikutusta, kun taas O-kytketty N-asetyyliglukosamiinimodifikaatio (O-GlcNAc) estää DELLA-TF-vuorovaikutusta. DELLA-fosforylaation rooli on kuitenkin epäselvä, koska aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet ristiriitaisia tuloksia. Jotkut viittaavat siihen, että fosforylaatio edistää tai estää DELLA-hajoamista, ja toiset viittaavat siihen, että fosforylaatio ei vaikuta niiden pysyvyyteen. Tässä tutkimuksessa tunnistamme massaspektrometrialla Arabidopsis thalianasta puhdistetun GA1-3-repressorin (RGA), AtDELLA:n, fosforylaatiokohdat ja osoitamme, että kahden RGA-peptidin fosforylaatio PolyS- ja PolyS/T-alueilla tehostaa RGA-aktiivisuutta edistämällä H2A:n sitoutumista ja RGA:n liittymistä kohdepromoottoreihin. Huomionarvoista on, että fosforylaatio ei vaikuttanut RGA-TF-vuorovaikutuksiin tai RGA:n pysyvyyteen. Tutkimuksemme paljastaa molekyylimekanismin, jolla fosforylaatio indusoi DELLA-aktiivisuutta.
Massaspektrometrinen analyysimme paljasti, että sekä Pep1 että Pep2 olivat voimakkaasti fosforyloituneita RGA:ssa GA-puutteisessa Ga1-taustassa. Tämän tutkimuksen lisäksi fosfoproteomiikkatutkimukset ovat myös paljastaneet Pep1:n fosforylaation RGA:ssa, vaikka sen roolia ei ole vielä tutkittu53,54,55. Sitä vastoin Pep2:n fosforylaatiota ei ole aiemmin kuvattu, koska tämä peptidi voitiin havaita vain käyttämällä RGAGKG-transgeeniä. Vaikka m1A-mutaatio, joka poisti Pep1:n fosforylaation, vähensi RGA:n aktiivisuutta vain hieman in planta, sillä oli additiivinen vaikutus yhdistettynä m2A:han RGA:n aktiivisuuden vähentämisessä (lisäkuva 6). Tärkeää on, että Pep1:n fosforylaatio väheni merkittävästi GA-tehostetussa sly1-mutantissa verrattuna ga1:een, mikä viittaa siihen, että GA edistää RGA:n defosforylaatiota ja vähentää sen aktiivisuutta. Mekanismi, jolla GA estää RGA:n fosforylaatiota, vaatii lisätutkimuksia. Yksi mahdollisuus on, että tämä saavutetaan tunnistamattoman proteiinikinaasin säätelyn kautta. Vaikka tutkimukset ovat osoittaneet, että GA vähentää CK1-proteiinikinaasi EL1:n ilmentymistä riisissä41, tuloksemme osoittavat, että Arabidopsis EL1 -homologin korkeamman asteen mutaatiot (AEL1-4) eivät vähennä RGA:n fosforylaatiota. Tulostemme mukaisesti äskettäin tehdyssä fosfoproteomiikkatutkimuksessa, jossa käytettiin Arabidopsis AEL:ää yliekspressoivia linjoja ja ael-kolmoismutanttia, ei tunnistettu yhtään DELLA-proteiinia näiden kinaasien substraatteiksi56. Käsikirjoitusta laatiessamme raportoitiin, että GSK3, vehnän (Triticum aestivum) GSK3/SHAGGY-tyyppistä kinaasia koodaava geeni, voi fosforyloida DELLA:a (Rht-B1b)57, vaikka Rht-B1b:n fosforylaatiota GSK3:lla ei ole vahvistettu in planta. In vitro -entsymaattiset reaktiot GSK3:n läsnä ollessa ja sitä seurannut massaspektrometria-analyysi paljastivat kolme fosforylaatiokohtaa Rht-B1b:n DELLA- ja GRAS-domeenien välissä (lisäkuva 3). Seriinin muuttuminen alaniiniksi kaikissa kolmessa fosforylaatiokohdassa johti Rht-B1b-aktiivisuuden vähenemiseen transgeenisessä vehnässä, mikä on yhdenmukaista havaintojemme kanssa, joiden mukaan alaniinin korvautumiset Pep2 RGA:ssa vähensivät RGA-aktiivisuutta. In vitro -proteiinien hajoamismääritykset osoittivat kuitenkin edelleen, että fosforylaatio voi myös stabiloida Rht-B1b57:ää. Tämä on ristiriidassa tulostemme kanssa, jotka osoittavat, että alaniinin korvautumiset Pep2 RGA:ssa eivät muuta sen stabiilisuutta plantassa. Vehnän GSK3 on brassinosteroidi-insensitiivisen proteiini 2:n (BIN2) ortologi Arabidopsis-kasvissa 57. BIN2 on BR-signaloinnin negatiivinen säätelijä, ja BR aktivoi sen signalointireittiä aiheuttamalla BIN2:n hajoamista 58. Osoitimme, että BR-käsittely ei vähennä RGA:n stabiilisuutta 59 tai fosforylaatiotasoja Arabidopsis-kasvissa (lisäkuva 2), mikä viittaa siihen, että BIN2 ei todennäköisesti fosforyloi RGA:ta.
Kaikki kvantitatiivinen data analysoitiin tilastollisesti Excelillä, ja merkitsevät erot määritettiin Studentin t-testillä. Otoskoon ennalta määrittämiseen ei käytetty tilastollisia menetelmiä. Analyysistä ei suljettu pois mitään dataa, koetta ei satunnaistettu, ja tutkijat olivat tietoisia otosjaottelusta kokeen ja tulosten arvioinnin aikana. Otoskoot on esitetty kuvioiden selitteissä ja raakadatatiedostoissa.
Julkaisuaika: 15. huhtikuuta 2025