DELLA-proteiinit säilyvätkasvunsäätelijätjoilla on keskeinen rooli kasvien kehityksessä vasteena sisäisiin ja ulkoisiin signaaleihin. Transkription säätelijöinä DELLA:t sitoutuvat transkriptiotekijöihin (TF) ja histoniin H2A GRAS-domeenien kautta, ja ne värvätään toimimaan promoottoreihin. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että DELLAn stabiilisuutta säätelee translaation jälkeisesti kaksi mekanismia: kasvihormonin aiheuttama polyubiquitinaatiogibberelliini, mikä johtaa niiden nopeaan hajoamiseen ja konjugaatioon pienen ubikvitiinin kaltaisen modifikaattorin (SUMO) kanssa, mikä lisää niiden kertymistä. Lisäksi DELLA-aktiivisuutta säätelee dynaamisesti kaksi erillistä glykosylaatiomekanismia: O-fukosylaatio tehostaa DELLA-TF-vuorovaikutusta, kun taas O-kytketyn N-asetyyliglukosamiinin (O-GlcNAc) modifikaatio estää DELLA-TF-vuorovaikutusta. DELLA-fosforylaation rooli on kuitenkin epäselvä, koska aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet ristiriitaisia tuloksia, ja jotkut viittaavat siihen, että fosforylaatio edistää tai tukahduttaa DELLAn hajoamista ja toiset viittaavat siihen, että fosforylaatio ei vaikuta niiden stabiilisuuteen. Täällä tunnistamme fosforylaatiokohdat GA1-3-repressorissa (RGA), AtDELLA, joka on puhdistettu Arabidopsis thalianasta massaspektrometrialla ja osoitamme, että kahden RGA-peptidin fosforylaatio PolyS- ja PolyS/T-alueilla lisää RGA-aktiivisuutta edistämällä H2A-sitoutumista ja RGA-assosiaatiota kohdepromoottorien kanssa. Erityisesti fosforylaatio ei vaikuttanut RGA-TF-vuorovaikutuksiin tai RGA-stabiilisuuteen. Tutkimuksemme paljastaa molekyylimekanismin, jolla fosforylaatio indusoi DELLA-aktiivisuutta.
Massaspektrometrinen analyysimme paljasti, että sekä Pep1 että Pep2 fosforyloituivat voimakkaasti RGA:ssa GA-puutteellisessa Ga1-taustassa. Tämän tutkimuksen lisäksi fosfoproteomiset tutkimukset ovat paljastaneet myös Pep1-fosforylaation RGA:ssa, vaikka sen roolia ei ole vielä tutkittu53,54,55. Sitä vastoin Pep2-fosforylaatiota ei ole aiemmin kuvattu, koska tämä peptidi voitiin havaita vain käyttämällä RGAGKG-siirtogeeniä. Vaikka m1A-mutaatio, joka poisti Pep1-fosforylaation, vähensi vain hieman RGA-aktiivisuutta plantassa, sillä oli additiivinen vaikutus yhdistettynä m2A:han vähentämään RGA-aktiivisuutta (täydentävä kuva 6). Tärkeää on, että Pep1-fosforylaatio väheni merkittävästi GA:lla tehostetussa sly1-mutantissa verrattuna ga1:een, mikä viittaa siihen, että GA edistää RGA-defosforylaatiota vähentäen sen aktiivisuutta. Mekanismi, jolla GA estää RGA-fosforylaatiota, vaatii lisätutkimuksia. Yksi mahdollisuus on, että tämä saavutetaan säätelemällä tunnistamatonta proteiinikinaasia. Vaikka tutkimukset ovat osoittaneet, että riisin GA vähentää CK1-proteiinikinaasin EL1 ekspressiota41, tuloksemme osoittavat, että Arabidopsis EL1 -homologin (AEL1-4) korkeamman asteen mutaatiot eivät vähennä RGA-fosforylaatiota. Tulostemme mukaisesti äskettäinen fosfoproteominen tutkimus, jossa käytettiin Arabidopsis AEL:n yli-ilmentäviä linjoja ja ael-kolmoismutanttia, ei tunnistanut mitään DELLA-proteiineja näiden kinaasien substraateiksi56. Kun valmistelimme käsikirjoitusta, ilmoitettiin, että GSK3, geeni, joka koodaa GSK3/SHAGGY-kaltaista kinaasia vehnässä (Triticum aestivum), voi fosforyloida DELLA (Rht-B1b)57, vaikka Rht-B1b:n fosforylaatiota GSK3:lla ei ole varmistettu kasveissa. In vitro -entsymaattiset reaktiot GSK3:n läsnäollessa, mitä seurasi massaspektrometria-analyysi, paljasti kolme fosforylaatiokohtaa, jotka sijaitsevat Rht-B1b:n DELLA- ja GRAS-domeenien välissä (täydentävä kuva 3). Seriini-alaniinisubstituutiot kaikissa kolmessa fosforylaatiokohdassa johtivat alentuneeseen Rht-B1b-aktiivisuuteen siirtogeenisessä vehnässä, mikä on yhdenmukainen havainteidemme kanssa, että alaniinisubstituutiot Pep2 RGA:ssa vähensivät RGA-aktiivisuutta. Kuitenkin in vitro -proteiinien hajoamismääritykset osoittivat edelleen, että fosforylaatio voi myös stabiloida Rht-B1b57:n. Tämä on päinvastoin kuin tulokset, jotka osoittavat, että alaniinisubstituutiot Pep2 RGA:ssa eivät muuta sen stabiilisuutta planta-tilassa. GSK3 vehnässä on brassinosteroideille epäsensitiivisen proteiini 2:n (BIN2) ortologi Arabidopsis 57:ssä. BIN2 on BR-signaloinnin negatiivinen säätelijä, ja BR aktivoi signalointireittinsä aiheuttamalla BIN2:n hajoamista 58. Osoitimme, että BR-hoito ei vähennä RGA:n stabiilisuutta 59. viittaa siihen, että BIN2 ei todennäköisesti fosforyloi RGA:ta.
Kaikki kvantitatiiviset tiedot analysoitiin tilastollisesti Excelillä ja merkittävät erot määritettiin Studentin t-testillä. Otoskoon ennalta määrittämiseen ei käytetty tilastollisia menetelmiä. Mitään tietoja ei jätetty pois analyysistä; koetta ei satunnaistettu; ja tutkijat olivat tietoisia jaosta kokeen ja tulosten arvioinnin aikana. Näytekoot on annettu kuvien selitteissä ja raakadatatiedostoissa.
Postitusaika: 15.4.2025