Torjunta-aineilla on ratkaiseva rooli maailmanlaajuisen ruokapulan ratkaisemisessa ja vektorivälitteisten ihmissairauksien torjunnassa. Kasvava torjunta-aineresistenssiongelma vaatii kuitenkin kiireellisesti uusien yhdisteiden löytämistä, jotka kohdistuvat alihyödynnettyihin kohteisiin. Hyönteisten transienttireseptoripotentiaalikanavat (TRPV) – Nanzhong (Nan) ja inaktiiviset kanavat (Iav) – voivat muodostaa heterologisia kanavia (Nan-Iav) ja lokalisoitua mekanosensorisiin elimiin, jotka välittävät hyönteisten geotropismia, kuuloa ja asentotuntoa. Jotkut torjunta-aineet, kuten afidopyrrolidoni (AP), kohdistuvat Nan-Iaviin tuntemattomien mekanismien kautta. AP tehoaa lävistäviin ja imeviin hyönteisiin (hemipteraneihin) estäen ruokailun häiritsemällä filamenttien toimintaa. AP voi sitoutua vain Naniin, mutta vain Nan-Iav voi vuorovaikuttaa agonistien, mukaan lukien endogeenisen nikotiiniamidin (NAM), kanssa, jolloin sillä on kanava-aktiivisuutta. Huolimatta Nan-Iavin potentiaalista hyönteismyrkkykohteena, sen kanavakokoonpanosta, säätelevistä sitoutumiskohdista ja Ca2+-riippuvaisesta säätelystä tiedetään vähän, mikä estää hyönteismyrkkyjen jatkokehitystä. Tässä tutkimuksessa kryoelektronimikroskopiaa käytettiin Nan-Iav:n rakenteen määrittämiseen Hemiptera-hyönteisissä kalmoduliiniligandittomassa tilassa sekä AP:n ja NAM:n kanssa ankyriinitoiston sytoplasmisen domeenin (ARD) rajalla. Yllättäen havaitsimme, että Nan-proteiini itsessään voi muodostaa pentameerin, jota AP:n välittämät ARD-vuorovaikutukset stabiloivat. Tämä tutkimus paljastaa hyönteismyrkkyjen ja agonistien sekä Nan-Iav:n välisiä molekyylivuorovaikutuksia, korostaa ARD:n merkitystä kanavien toiminnassa ja kokoonpanossa sekä tutkii Ca2+-säätelymekanismia.
Yhä ankaramman maailmanlaajuisen ilmastonmuutoksen taustalla heikkenevä maailmanlaajuinen ruokaturva on yksi 2000-luvun suurimmista haasteista, jolla on yhteiskunnalle laaja-alaisia seurauksia.1,2Maailman terveysjärjestön SOFI-raportissa (State of Food Security and Nutrition in the World 2023) arvioidaan, että maailmanlaajuisesti noin 2,33 miljardia ihmistä kärsii keskivaikeasta tai vakavasta ruokaturvattomuudesta, joka on pitkäaikainen ongelma.3,4Valitettavasti arviolta 20–30 % tai enemmän sadosta menetetään vuosittain tuholaisten ja taudinaiheuttajien vuoksi, ja ilmaston lämpenemisen odotetaan pahentavan tuholaisten vastustuskykyä ja satojen haavoittuvuutta.4, 5, 6, 7, 8Torjunta-aineiden kehittäminen on ratkaisevan tärkeää paitsi viljelykasvien suojelemiseksi tuholaisilta ja vektorivälitteisten taudinaiheuttajien leviämisen vähentämiseksi, myös vektorivälitteisten ihmissairauksien, kuten denguekuumeen, malarian ja Chagasin taudin, torjumiseksi, sillä ne ovat yhä resistenttejä torjunta-aineille.5, 9, 10, 11
Neurotoksisten hyönteismyrkkyjen tärkeimmistä kohteista heterotetrameerinen TRPV-kanava Nanchung (Nan) -Inactive (Iav) edustaa vasta viimeisen vuosikymmenen aikana löydettyjen hyönteismyrkkykohteiden luokkaa, mukaan lukien kaupallisesti saatavilla olevat hyönteismyrkyt, kuten imidaklopridi ja pyraklostrobiini.12, 13, 14Puolisynteettinen hyönteismyrkky apidopyrrolifeeni (AP) on äskettäin kehitetty ja kaupallistettu tuote, jonka pääkomponentti on vaikuttava hyönteismyrkky Inscalis®, joka sitoutuu AP:hen subnanomolaarisella aktiivisuustasolla.15AP:n akuutti myrkyllisyys pölyttäjille, hyödyllisille hyönteisille ja muille ei-kohde-eliöille on vähäistä, ja kun sitä käytetään pakkausselosteen ohjeiden mukaisesti, se voi vähentää resistenssipainetta muille hyönteismyrkkyille.16, 17, 18Nan ja Iav ovat laajalti levinneet hyönteislajeihin, niitä ilmennetään yhdessä vain tuntosarvien ja raajojen jännevälitteisissä reseptorineuroneissa, ja ne ovat kriittisiä kuulolle, painovoiman havaitsemiselle ja asentoaistin kannalta.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidaklopridi ja pyraklostrobiini stimuloivat Nan-Iav-kompleksia ainutlaatuisen mekanismin kautta, mikä lopulta estää proprioseptiivisen signaalitransduktion.13, 16, 23Lävistäviä ja imeviä hyönteisiä (hemipteraneja), kuten kirvoja ja jauhiaisia, asentoaistin menetys heikentää niiden ruokailukykyä ja johtaa lopulta kuolemaan.13,24Mielenkiintoista kyllä, AP:llä on korkea affiniteetti Nan-Iav-kompleksiin ja matala affiniteetti pelkkään Naniin. AP:n sitoutuminen Nan-Iaviin indusoi sähkövirran, mutta pelkkään Naniin sitoutuminen ei stimuloi kanavan aktiivisuutta. Iav itsessään ei sitoudu AP:hen lainkaan.16Tämä viittaa siihen, että Nan ja Iav voivat sitoutua muodostaen erilaisia Nan-Iav-kanavakomplekseja (esim. eri stoikiometrisilla suhteilla tai erilaisilla järjestelyillä saman stoikiometrisen suhteen sisällä) tai että AP voi sitoutua useisiin kohtiin. Lisäksi luonnollinen agonisti nikotiiniamidi (NAM) sitoutuu Drosophila Nan-Iaviin mikromolaarisella affiniteetilla, ja sen vaikutukset ovat samanlaisia kuin kirvojen (AP) vaikutukset in vitro.16,25ja estää kirvojen lisääntymistä ja ruokailua, mikä lopulta johtaa niiden kuolemaan25,26Nämä tiedot herättävät monia kysymyksiä. Esimerkiksi on edelleen epäselvää, miten Nan-Iav-heterodimeeri muodostuu, mitä sitoutumiskohtia käytetään pienten molekyylien modulointiin ja miten nämä pienet molekyylit säätelevät kanavien toimintaa estämällä proprioseptiivista toimintaa. Lisäksi syyt, miksi Nan itsessään on inaktiivinen ja sillä on alhainen affiniteetti AP:hen, kun taas Nan-Iav-heterodimeeri on aktiivinen ja sitoutuu AP:hen suuremmalla affiniteetilla, ovat edelleen epäselviä. Lopuksi, Nan-Iav-toiminnan Ca2+-riippuvaisesta säätelystä ja siitä, miten se integroituu hermosolujen signalointiprosesseihin, tiedetään vähän.. 13,21
Tässä kryoelektronimikroskopiaa, elektrofysiologiaa ja radioligandin sitoutumistekniikoita yhdistävässä tutkimuksessa selvitimme Nan-Iav:n kokoonpanoa ja sen sitoutumismekanismia pienimolekyylisiin säätelijöihin. Lisäksi havaitsimme Iav:iin konstitutiivisesti sitoutunutta kalmoduliinia (CaM) ja AP-stabiloituja Nan-pentameerejä. Nämä tulokset antavat tärkeää tietoa kalsiumionien säätelyyn kanavissa, kanavien kokoonpanoon ja ligandin sitoutumisaffiniteettia määrääviin tekijöihin. Vielä tärkeämpää on, että vahvistimme, että ARD:llä on keskeinen rooli näissä prosesseissa. Tutkimuksemme kokonaisista hyönteiskanavista, jotka ovat sitoutuneet merkityksellisiin maatalouden torjunta-aineisiin.27, 28, 29avaa mahdollisuuksia torjunta-aineteollisuuden kehitykselle, parantaa torjunta-aineiden tehokkuutta ja spesifisyyttä sekä mahdollistaa TRPV-kohdennettujen yhdisteiden käytön muihin lajeihin maailmanlaajuisen ruokaturvan ja vektorivälitteisten tautien leviämisen torjumiseksi.
Havaitsimme myös, että Nan-Iav:ia säätelee Ca2+, ja säätelymekanismi välittyy konstitutiivisesti sitoutuneen CaM:n kautta. Merkittävää on, että tämä Ca2+:sta riippuva Nav:n säätely CaM:n toimesta eroaa merkittävästi muiden ionikanavien (esim. jänniteherkkien Na+-kanavien ja TRPV5/6-kanavien) säätelymekanismeista.52, 53, 54, 55, 56, 57Nav1.2-kanavassa CaM:n C-terminaalinen domeeni liittyy heliksisesti C-terminaaliseen domeeniin (CTD), ja Ca2+ indusoi sen N-terminaalisen domeenin sitoutumisen CTD:n distaaliseen osaan.56TRPV5/6-kanavassa CaM:n C-terminaalinen domeeni sitoutuu CTH:hon, ja Ca2+ indusoi sen N-terminaalisen domeenin laajenemisen ylöspäin huokosiin, mikä estää kationien läpäisevyyden.53,54Esitämme mallin Nan-Iav-CaM:n Ca2+-säätelemälle toiminnalle (kuva 4h). Tässä mallissa CaM:n N-terminaalinen domeeni sitoutuu konstitutiivisesti Iav:n C-terminaaliseen domeeniin (CTH). Lepotilassa (alhainen [Ca2+]-pitoisuus) CaM:n C-terminaalinen domeeni on vuorovaikutuksessa Nanin kanssa, vakauttaen ARD:n konformaatiota ja edistäen siten kanavan avautumista. Agonistin/hyönteismyrkyn sitoutuminen kanavaan indusoi huokosten avautumisen, mikä johtaa Ca2+-virtaukseen. Ca2+ sitoutuu sitten CaM:ään, aiheuttaen C-terminaalisen domeenin irtoamisen Nanin ARD:stä. Koska CaM:n sitoutumisen estäminen olennaisesti poistaa Ca2+:n estävän vaikutuksen, tämä dissosiaatio moduloi ARD:n liikkuvuutta, aiheuttaen siten Ca2+-riippuvaisen eston tai desensitisaation. Kanavavirtojen nopea palautuminen kalsiumionien eluoinnin jälkeen (kuva 4g) viittaa siihen, että tämä mekanismi helpottaa nopeita vasteita Ca2+-välitteisiin hermosolusignaaleihin. Lisäksi Iav:n C-terminaalisen alueen, jota ei vielä tunneta hyvin, on raportoitu olevan muissa rooleissa kanavien kohdentamisessa ja virran säätelyssä.21
Lopuksi tutkimuksemme esittelee maataloudelle tärkeän hyönteismyrkky-hyönteismyrkky TRP-kanavakompleksin tarkan rakenteen – meille aiemmin tuntemattoman löydön. Erityisesti karakterisoimme hyönteiskanavan rakenteen ja toiminnan ihmissoluissa (HEK293S GnTi–) pikemminkin kuin hyönteissoluissa. Kasvavan hyönteismyrkkyresistenssin ja jatkuvan ruokaturvaan ja taudinaiheuttajiin kohdistuvan paineen edessä työmme tarjoaa tärkeää tietoa, joka helpottaa uusien hyönteismyrkkyjen kehittämistä ihmisten terveyden ja maailmanlaajuisen ruokaturvan hyödyksi. Tutkimukset ovat osoittaneet, että hyönteismyrkyt, kuten AP, ovat tehokkaita joitakin tuholaisia vastaan, kun niitä käytetään pakkausselosteen ohjeiden mukaisesti, ja niiden akuutti myrkyllisyys hyödyllisille pölyttäjille on vähäistä, mikä osoittaa niiden ympäristöturvallisuuden.13,16Lisäksi joidenkin AP-johdannaisten testaaminen hyttysillä on osoittanut, että ne menettävät lopulta kykynsä lentää. Ymmärtämällä, miten nämä moduloivat yhdisteet sitoutuvat Nan-Iaviin, helpotetaan olemassa olevien yhdisteiden modifiointia tai uusien yhdisteiden kehittämistä tehokkaampien ja tehokkaampien menetelmien aikaansaamiseksi.tarkkatuholaistorjunta. Tutkimuksemme osoittaa, että Nan-Iav ARD -rajapinta on kriittinen paitsi endogeenisten yhdisteiden, torjunta-aineiden ja Ca2+-CaM:n aktiivisuuden säätelyssä myös ionikanavan kokoonpanossa. Ehdotamme, että heterodimeerin kokoonpanon häiritseminen pienillä molekyyleillä voi olla ainutlaatuinen ja lupaava lähestymistapa ionikanavan estäjien kehittämiseen.
Kahdeksasta ortologisesta geenistä valittiin ruskokuoriaisen (Halyomorpha halys) täyspitkät geenit Nanchung ja Inactive, joilla oli erinomainen stabiilius pesuaineissa. Syntetisoidut geenit kodonioptimoitiin ihmisilmentymistä varten ja kloonattiin pBacMam pCMV-DEST -vektoriin (Life Technologies) käyttämällä XhoI- ja EcoRI-restriktiokohtia. Tämä varmisti, että kloonit olivat lukukehyksessä C-terminaalisten GFP-FLAG-10xHis- ja mCherry-FLAG-10xHis-merkkien kanssa, jotka HRC-3C-proteaasi (PPX) katkaisee, mikä mahdollistaa itsenäisen...ilmaisuNanchungin ja Inactiven kloonaamiseen pBacMam-vektoriin käytetyt alukkeet olivat seuraavat:
Yksittäisten hiukkasten mikroskooppiset kuvat saatiin Titan Krios G2 -transmissioelektronimikroskoopilla (FEI), joka oli varustettu K3-kameralla ja Gatan BioQuantum -energiasuodattimella. Mikroskooppia käytettiin 300 keV:n jännitteellä, 20 eV:n energia-asetuksella, 1,08 Å/pikseli -näytteen pikselikoolla (nimellissuurennus 81 000x) ja epäterävyysgradientilla välillä -0,8 - -2,2 μm. Videotallennus suoritettiin 40 kuvan sekuntinopeudella käyttäen Latitude S -mikroskooppia (Gatan) nimellisellä annosnopeudella 25 e–px−1 s−1, valotusajalla 2,4 s ja kokonaisannoksella noin 60 e–Å−2.
Säteen aiheuttaman liikkeen korjaus ja annospainotus tehtiin filmille käyttämällä MotionCor2-ohjelmistoa RELION 4.061 -ohjelmistossa. Kontrastinsiirtofunktion (CTF) parametrien estimointi suoritettiin cryoSPARC-ohjelmistossa käyttämällä laikupohjaista CTF-estimointimenetelmää62. Mikrovalokuvat, joiden CTF-sovitusresoluutio oli ≥4 Å, jätettiin pois myöhemmästä analyysistä. Tyypillisesti cryoSPARC-ohjelmistossa käytettiin 500–1000 mikrovalokuvan osajoukkoa pisteiden valintaan, minkä jälkeen suoritettiin useita 2D-luokittelukierroksia suodatuksen jälkeen, jotta saatiin selkeä referenssikuva templaattipohjaista hiukkasvalintaa varten. Hiukkaset erotettiin sitten käyttämällä 64 pikselin rajaavia laatikoita ja 4-kertaista ryhmittelyä. Useita 2D-luokittelukierroksia suoritettiin ei-toivottujen hiukkasluokkien poistamiseksi. Alkuperäinen 3D-malli rekonstruoitiin käyttämällä ab initio -rekonstruktiota ja tarkennettiin käyttämällä epätasaista tarkennusta cryoSPARC-ohjelmistossa. 3D-luokittelu suoritettiin cryoSPARC- tai RELION-ohjelmistossa ARD-heterogeenisyyden perusteella. Kalvodomeenien merkittävää heterogeenisyyttä ei havaittu. Hiukkaset tarkennettiin käyttämällä C1- ja C2-menetelmiä; Korkeamman C2-resoluution omaavat hiukkaset katsottiin symmetrisiksi C2:n suhteen ja tuotiin RELIONiin Bayes-tarkkuutta varten. Sitten hiukkaset siirrettiin takaisin cryoSPARCiin lopullista epätasaista ja paikallista tarkennusta varten. Lopullinen resoluutio ja hiukkasmäärät on esitetty taulukossa 1.
Nan+AP-pentameerejä käsitellessämme tutkimme erilaisia menetelmiä kalvodomeenien (erityisesti huokosalueen) resoluution parantamiseksi, kuten signaalinvähennystä ja TMD-maskausta. Nämä yritykset eivät kuitenkaan onnistuneet huokosalueen mahdollisesti äärimmäisen epäjärjestyksen ja TMD:n yleisen heterogeenisyyden vuoksi. Lopullinen resoluutio laskettiin käyttämällä cryoSPARCin epätasaisen prosessointimenetelmän automaattisesti luomaa maskia, joka kohdistui ensisijaisesti ARD-alueeseen. Näin saavutettiin huomattavasti korkeampi resoluutio kuin kalvodomeeneilla (erityisesti VSLD-alueella).
Nanchung- ja inaktiivisten bugien apo-muotojen alustavat de novo -mallit luotiin ensin Coot63-ohjelmistolla, ja Nan- ja Iav-bugien mallit AlphaFold264-ohjelmistolla epäluotettavien alueiden tunnistamiseksi. Kalmoduliinimallinnus perustui Ca2+-sitoutuvien ja Ca2+-vapaiden mallien jäykkään kappaleeseen sovituksiin PDB-liittymissä 4JPZ56 ja 1CFD65. Malleja tarkennettiin pallomaisella tarkennuksella oikean stereokemian ja hyvän geometrian varmistamiseksi. Fosfatidyylikoliini, fosfatidyylietanoliamiini ja fosfatidyyliseriini mallinnettiin sitten hyvin määriteltyinä lipiditiheyksinä, ja NAM- ja AP-ligandit sijoitettiin vastaaviin tiheyksiin tiiviissä liitoksissa. Rajoitetiedostot luotiin isoformien SMILES-merkkijonosta käyttämällä eLBOW-ohjelmistoa PHENIX66-ohjelmistossa. Lopuksi mallit tarkennettiin reaalitilassa PHENIX-ohjelmistossa käyttämällä paikallista ruudukkohakua ja globaalia minimointia toissijaisten rakennerajoitteiden avulla. Mallin tarkennukseen ja rakenneanalyysiin käytettiin MolProbity-palvelinta, ja kuvitukset tehtiin PyMOLilla ja UCSF Chimera X:llä.67,68,69 Aukkoanalyysi suoritettiin HOLE-palvelimella70 ja sekvenssien säilyvyyskartoitus Consurf-palvelimella71.
Tilastollinen analyysi suoritettiin Igor Pro 6.2-, Excel Office 365- ja GraphPad Prism 7.0 -ohjelmilla. Kaikki kvantitatiiviset tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe (SEM). Kahden ryhmän vertailuun käytettiin Studentin t-testiä (kaksisuuntainen, parittamaton). Useiden ryhmien vertailuun käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysia (ANOVA) ja sen jälkeen Dunnettin post hoc -testiä. *P< 0,05, **P< 0,01 ja ***P< 0,001 katsottiin tilastollisesti merkitseviksi datajakaumasta riippuen. Kd- ja Ki-arvot sekä niiden epäsymmetriset 95 %:n luottamusvälit laskettiin GraphPad Prism 10 -ohjelmistolla.
Lisätietoja tutkimusmenetelmästä on tässä artikkelissa linkitetyssä Nature Portfolio -raportin yhteenvedossa.
Alkuperäinen malli rakennettiin käyttämällä PDB 4JPZ- ja 1CFD-tietokantojen kalmoduliinimalleja. Koordinaatit on tallennettu Protein Data Bankiin (PDB) talletusnumeroilla 9NVN (Nan-Iav-CaM ilman ligandia), 9NVO (Nan-Iav-CaM sitoutunut nikotiiniamidiin), 9NVP (Nan-Iav-CaM sitoutunut nikotiiniamidiin ja EDTA:han), 9NVQ (Nan-Iav-CaM sitoutunut apenidolipyrroliiniin ja kalsiumiin), 9NVR (Nan-Iav-CaM sitoutunut apenidolipyrroliiniin ja EDTA:han) ja 9NVS (Nan-pentameeri sitoutunut apenidolipyrroliiniin). Vastaavat kryoelektronimikroskopiakuvat on tallennettu elektronimikroskopiatietokantaan (EMDB) seuraavilla tunnistenumeroilla: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ilman ligandia), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-kompleksi nikotinamidin kanssa), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-kompleksi nikotinamidin ja EDTA:n kanssa), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-kompleksi apidopyrroliinin ja kalsiumin kanssa), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-kompleksi apidopyrroliinin ja EDTA:n kanssa) ja EMD-49849 (Nan-pentameerikompleksi apidopyrroliinin kanssa). Funktionaalisen analyysin raakatiedot esitetään tässä artikkelissa.
Julkaisun aika: 28. tammikuuta 2026