Anthelminttinen lääke N,N-dietyyli-m-toluamidi (DEET) on raportoitu estävän AChE:tä (asetyylikoliiniesteraasia) ja sillä on mahdollisesti syöpää aiheuttavia ominaisuuksia liiallisesta vaskularisaatiosta johtuen. Tässä artikkelissa osoitamme, että DEET stimuloi spesifisesti endoteelisoluja, jotka edistävät angiogeneesiä, mikä lisää kasvaimen kasvua. DEET aktivoi soluprosesseja, jotka johtavat angiogeneesiin, mukaan lukien proliferaatio, migraatio ja adheesio. Tämä liittyy lisääntyneeseen NO-tuotantoon ja VEGF-ilmentymiseen endoteelisoluissa. M3:n vaimentaminen tai farmakologisten M3-estäjien käyttö poisti kaikki nämä vaikutukset, mikä viittaa siihen, että DEET-indusoitu angiogeneesi on M3-herkkä. Kokeet, jotka koskevat kalsiumsignalointia M3-reseptoreita yli-ilmentävissä endoteelisoluissa ja HEK-soluissa, sekä sitoutumis- ja telakointitutkimukset osoittavat, että DEET toimii M3-reseptorien allosteerisena modulaattorina. Lisäksi DEET estää AChE:tä, mikä lisää asetyylikoliinin biologista hyötyosuutta ja sen sitoutumista M3-reseptoreihin ja tehostaa proangiogeenisiä vaikutuksia allosteerisen säätelyn kautta.
Primaariset EC:t eristettiin Sveitsin hiirten aortasta. Uuttomenetelmä mukautettiin Kobayashi-protokollasta 26 . Hiiren EC:itä viljeltiin EBM-2-elatusaineessa, jota oli täydennetty 5 % lämpöinaktivoidulla FBS:llä neljänteen viljelyyn asti.
Kahden DEET-pitoisuuden vaikutus HUVEC:n, U87MG:n tai BF16F10:n proliferaatioon analysoitiin käyttämällä CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit -sarjaa (Molecular Probes, C7026). Lyhyesti sanottuna 5,103 solua kuoppaa kohti kylvettiin 96-kuoppaiselle levylle, annettiin kiinnittyä yön yli ja sitten käsiteltiin DEET:llä 24 tunnin ajan. Kasvualustan poistamisen jälkeen lisää väriä sitovaa liuosta mikrolevyn jokaiseen kuoppaan ja inkuboi soluja 37 °C:ssa 30 minuuttia. Fluoresenssitasot määritettiin käyttämällä Mithras LB940 -monimoodimikrolevylukijaa (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa), joka oli varustettu 485 nm:n virityssuodattimilla ja 530 nm:n emissiosuodattimilla.
HUVEC:t kylvettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 104 solua kuoppaa kohti. Soluja käsiteltiin DEET:llä 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä kolorimetristä MTT-määritystä (Sigma-Aldrich, M5655). Optiset tiheysarvot saatiin monimuotoisella mikrolevylukijalla (Mithras LB940) aallonpituudella 570 nm.
DEET:n vaikutuksia tutkittiin käyttämällä in vitro angiogeneesimäärityksiä. Käsittely 10-8 M tai 10-5 M DEET:llä lisäsi kapillaaripituuden muodostumista HUVEC:issa (kuvat 1a, b, valkoiset palkit). Verrattuna kontrolliryhmään, hoito DEET-pitoisuuksilla välillä 10-14 ja 10-5 M osoitti, että kapillaaripituus saavutti tasanteen 10-8 M DEET:ssä (täydentävä kuva S2). Merkittäviä eroja ei havaittu DEET:llä käsiteltyjen HUVEC:ien proangiogeenisessa vaikutuksessa in vitro pitoisuuksilla 10-8 M ja 10-5 M.
Määrittääksemme DEET:n vaikutuksen neovaskularisaatioon suoritimme in vivo neovaskularisaatiotutkimuksia. 14 päivän kuluttua hiirillä, joihin oli injektoitu endoteelisoluja, joita oli esiviljelty 10-8 M tai 10-5 M DEET:llä, havaittiin merkittävä hemoglobiinipitoisuuden nousu (kuvio 1c, valkoiset palkit).
Lisäksi DEET-indusoitua uudissuonittumista tutkittiin U87MG-ksenograftia kantavilla hiirillä, joille injektoitiin päivittäin (ip) DEET:tä annoksella, jonka tiedettiin indusoivan plasman pitoisuuksia 10-5 M, mikä on normaalia altistuneilla ihmisillä. 23. Havaittavissa olevia kasvaimia (eli kasvaimia > 100 mm3) havaittiin 14 päivää U87MG-solujen injektion jälkeen hiiriin. Päivänä 28 kasvaimen kasvu tehostui merkittävästi DEET-käsitellyissä hiirissä verrattuna kontrollihiiriin (kuvio 1d, neliöt). Lisäksi kasvainten CD31-värjäys osoitti, että DEET lisäsi merkittävästi kapillaarialuetta, mutta ei mikroverisuonitiheyttä. (Kuvat 1e–g).
Muskariinireseptorien roolin määrittämiseksi DETA-indusoidussa proliferaatiossa käytettiin 10-8 M tai 10-5 M DETA:ta pFHHSiD:n (10-7 M, selektiivinen M3-reseptorin antagonisti) läsnä ollessa. HUVEC:n hoito. pFHHSiD esti täysin DETA:n proliferatiiviset ominaisuudet kaikilla pitoisuuksilla (taulukko 1).
Näissä olosuhteissa tutkimme myös, lisäisikö DEET hiussuonien pituutta HUVEC-soluissa. Samoin pFHHSiD esti merkittävästi DEET-indusoitua kapillaarin pituutta (kuviot la, b, harmaat palkit). Lisäksi samanlaisia kokeita suoritettiin M3 siRNA:lla. Vaikka kontrolli-siRNA ei ollut tehokas edistämään hiussuonien muodostumista, M3-muskariinireseptorin hiljentäminen poisti DEET:n kyvyn lisätä kapillaarin pituutta (kuvio 1a, b, mustat palkit).
Lisäksi sekä 10-8 M tai 10-5 M DEET-indusoitu vaskularisaatio in vitro ja neovaskularisaatio in vivo esti täysin pFHHSiD:llä (kuvio 1c, d, ympyrät). Nämä tulokset osoittavat, että DEET edistää angiogeneesiä reitin kautta, joka on herkkä selektiivisille M3-reseptorin antagonisteille tai M3-siRNA:lle.
AChE on DEET:n molekyylikohde. Lääkkeet, kuten donepetsiili, jotka toimivat AChE:n estäjinä, voivat stimuloida EC-angiogeneesiä in vitro ja hiiren takaraajojen iskemiamalleissa14. Testasimme kahden DEET-pitoisuuden vaikutusta AChE-entsyymiaktiivisuuteen HUVECissa. Matalat (10-8 M) ja korkeat (10-5 M) DEET-pitoisuudet vähensivät endoteelin AChE-aktiivisuutta kontrolliolosuhteisiin verrattuna (kuvio 2).
Molemmat DEET-pitoisuudet (10-8 M ja 10-5 M) vähensivät asetyylikoliiniesteraasiaktiivisuutta HUVEC:ssä. BW284c51:tä (10-5 M) käytettiin asetyylikoliiniesteraasi-inhibiittoreiden kontrollina. Tulokset ilmaistaan prosentteina AChE-aktiivisuudesta kahdella DEET-pitoisuudella käsitellyssä HUVEC:ssä verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Arvot ilmaistaan kuuden riippumattoman kokeen keskiarvona ± SEM. *p < 0,05 verrattuna kontrolliin (Kruskal-Wallis ja Dunnin moninkertainen vertailutesti).
Typpioksidi (NO) osallistuu angiogeeniseen prosessiin33, joten NO-tuotantoa tutkittiin DEET-stimuloiduissa HUVEC-soluissa. DEET-käsitelty endoteeli-NO-tuotanto lisääntyi verrattuna kontrollisoluihin, mutta saavutti merkitsevän eron vasta annoksella 10-8 M (kuva 3c). DEET-indusoitua NO-tuotantoa säätelevien molekyylitason muutosten määrittämiseksi analysoitiin eNOS:n ilmentymistä ja aktivaatiota Western blot -menetelmällä. Vaikka DEET-käsittely ei muuttanut eNOS:n ilmentymistä, se lisäsi merkittävästi eNOS:n fosforylaatiota sen aktivointikohdassa (Ser-1177) ja samalla vähensi sen inhiboivaa kohtaa (Thr-495) verrattuna käsittelemättömiin soluihin eNOS:n fosforylaatiossa (kuva 3d). Lisäksi fosforyloitujen eNOS:n suhde aktivointikohdassa ja inhiboivassa kohdassa laskettiin sen jälkeen, kun fosforyloidun eNOS:n määrä oli normalisoitu entsyymin kokonaismäärään. Tämä suhde kasvoi merkittävästi HUVEC-soluissa, joita käsiteltiin kullakin DEET-pitoisuudella verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuva 3d).
Lopuksi VEGF:n, yhden tärkeimmistä proangiogeenisista tekijöistä, ilmentyminen analysoitiin Western blot -menetelmällä. DEET lisäsi merkittävästi VEGF-ilmentymistä, kun taas pFHHSiD esti tämän ilmentymisen kokonaan.
Koska DEET:n vaikutukset ovat herkkiä sekä M3-reseptorien farmakologiselle salpaukselle että alasäätelylle, testasimme hypoteesia, että DEET voisi tehostaa kalsiumin signalointia. Yllättäen DEET ei onnistunut lisäämään sytoplasmista kalsiumia HUVEC:ssä (tietoja ei esitetty) ja HEK/M3:ssa (kuvio 4a, b) molemmilla käytetyillä pitoisuuksilla.
Postitusaika: 30.12.2024