Matolääke N,N-dietyyli-m-toluamidi (DEET) on raportoitu estävän AChE:tä (asetyylikoliesteraasia) ja sillä on mahdollisesti karsinogeenisia ominaisuuksia liiallisen verisuonituksen vuoksi. Tässä artikkelissa osoitamme, että DEET stimuloi spesifisesti endoteelisoluja, jotka edistävät angiogeneesiä, mikä lisää kasvaimen kasvua. DEET aktivoi soluprosesseja, jotka johtavat angiogeneesiin, mukaan lukien proliferaatio, migraatio ja adheesio. Tämä liittyy lisääntyneeseen NO-tuotantoon ja VEGF:n ilmentymiseen endoteelisoluissa. M3:n hiljentäminen tai farmakologisten M3-estäjien käyttö poisti kaikki nämä vaikutukset, mikä viittaa siihen, että DEET:n indusoima angiogeneesi on M3-herkkää. Kokeet, joissa on mukana kalsiumsignalointia M3-reseptoreita yliekspressoivissa endoteelisoluissa ja HEK-soluissa, sekä sitoutumis- ja telakointitutkimukset osoittavat, että DEET toimii M3-reseptorien allosteerisenä modulaattorina. Lisäksi DEET estää AChE:tä, mikä lisää asetyylikoliinin biologista hyötyosuutta ja sen sitoutumista M3-reseptoreihin ja tehostaa proangiogeenisiä vaikutuksia allosteerisen säätelyn kautta.
Primaariset endoteelisolut eristettiin sveitsiläisten hiirten aortasta. Uuttomenetelmä oli mukautettu Kobayashi-protokollasta26. Hiiren endoteelisoluja viljeltiin EBM-2-elatusaineessa, johon oli lisätty 5 % lämmöllä inaktivoitua FBS:ää, neljänteen viljelykertaan asti.
Kahden DEET-pitoisuuden vaikutusta HUVEC-, U87MG- tai BF16F10-solujen lisääntymiseen analysoitiin CyQUANT Cell Proliferation Assay -pakkauksella (Molecular Probes, C7026). Lyhyesti sanottuna 96-kuoppalevylle kylvettiin 5,103 solua kuoppaa kohden, annettiin kiinnittyä yön yli ja sitten käsiteltiin DEET:llä 24 tuntia. Kasvualustan poistamisen jälkeen lisätään väriainetta sitovaa liuosta mikrolevyn jokaiseen kuoppaan ja soluja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuuttia. Fluoresenssia määritettiin Mithras LB940 -monimuotomikrolevynlukijalla (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa), joka oli varustettu 485 nm:n virityssuodattimilla ja 530 nm:n emissiosuodattimilla.
HUVEC-solut kylvettiin 96-kuoppalevyille tiheydellä 104 solua kuoppaa kohden. Soluja käsiteltiin DEET:llä 24 tunnin ajan. Solujen elinkyky arvioitiin kolorimetrisellä MTT-määrityksellä (Sigma-Aldrich, M5655). Optiset tiheysarvot saatiin monimuotolevylukijalla (Mithras LB940) aallonpituudella 570 nm.
DEET:n vaikutuksia tutkittiin in vitro -angiogeneesimäärityksillä. 10-8 M tai 10-5 M DEET:llä käsittely lisäsi kapillaarien pituuden muodostumista HUVEC-soluissa (kuva 1a, b, valkoiset palkit). Kontrolliryhmään verrattuna 10-14 - 10-5 M DEET-pitoisuuksilla käsittely osoitti, että kapillaarien pituus saavutti tasaantumisen 10-8 M DEET-pitoisuudessa (lisäkuva S2). DEET:llä käsiteltyjen HUVEC-solujen in vitro -proangiogeenisessä vaikutuksessa ei havaittu merkittävää eroa pitoisuusalueella 10-8 M ja 10-5 M.
DEET:n vaikutuksen neovaskularisaatioon määrittämiseksi suoritimme neovaskularisaatiotutkimuksia in vivo. 14 päivän kuluttua hiirillä, joille oli injektoitu 10-8 M tai 10-5 M DEET:llä esiviljeltyjä endoteelisoluja, havaittiin merkittävä hemoglobiinipitoisuuden nousu (kuva 1c, valkoiset palkit).
Lisäksi DEET:n aiheuttamaa neovaskularisaatiota tutkittiin U87MG-ksenograftin saaneilla hiirillä, joille injektoitiin päivittäin (ip) DEET:tä annoksella, jonka tiedetään aiheuttavan 10-5 M:n plasmapitoisuuden, mikä on normaali altistuneilla ihmisillä. Tutkimuksessa 23 havaittavia kasvaimia (eli kasvaimia > 100 mm3) havaittiin 14 päivää U87MG-solujen injektoinnin jälkeen hiiriin. Päivänä 28 kasvaimen kasvu oli merkittävästi lisääntynyt DEET:llä käsitellyillä hiirillä verrattuna kontrollihiiriin (kuva 1d, neliöt). Lisäksi kasvainten CD31-värjäys osoitti, että DEET lisäsi merkittävästi kapillaaripinta-alaa, mutta ei mikroverisuonitiheyttä (kuva 1e–g).
Muskariinireseptorien roolin määrittämiseksi DETA:n indusoimassa proliferaatiossa käytettiin 10-8 M tai 10-5 M DETAa pFHHSiD:n (10-7 M, selektiivinen M3-reseptoriantagonisti) läsnä ollessa. HUVEC-käsittely. pFHHSiD esti DETAn proliferatiiviset ominaisuudet kokonaan kaikilla pitoisuuksilla (taulukko 1).
Näissä olosuhteissa tutkimme myös, lisäisikö DEET kapillaarien pituutta HUVEC-soluissa. Vastaavasti pFHHSiD esti merkittävästi DEET:n indusoimaa kapillaarien pituutta (kuva 1a, b, harmaat palkit). Lisäksi samanlaisia kokeita tehtiin M3 siRNA:lla. Vaikka kontrolli-siRNA ei edistänyt tehokkaasti kapillaarien muodostumista, M3-muskariinireseptorin hiljentäminen poisti DEET:n kyvyn lisätä kapillaarien pituutta (kuva 1a, b, mustat palkit).
Lisäksi sekä 10-8 M että 10-5 M DEET:n indusoima verisuonittuminen in vitro että neovaskularisaatio in vivo estyivät täysin pFHHSiD:llä (kuva 1c, d, ympyrät). Nämä tulokset osoittavat, että DEET edistää angiogeneesiä selektiivisille M3-reseptoriantagonisteille tai M3 siRNA:lle herkän reitin kautta.
AChE on DEET:n molekyylikohde. Lääkkeet, kuten donepetsiili, jotka toimivat AChE:n estäjinä, voivat stimuloida endoteelin angiogeneesiä in vitro ja hiiren takaraajojen iskemiamalleissa14. Testasimme kahden DEET-pitoisuuden vaikutusta AChE-entsyymiaktiivisuuteen HUVEC-soluissa. Matala (10-8 M) ja korkea (10-5 M) DEET-pitoisuus vähensivät endoteelin AChE-aktiivisuutta verrattuna kontrolliolosuhteisiin (kuva 2).
Molemmat DEET-pitoisuudet (10-8 M ja 10-5 M) vähensivät asetyylikoliesteraasiaktiivisuutta HUVEC-soluissa. BW284c51:tä (10-5 M) käytettiin asetyylikoliesteraasin estäjien kontrollina. Tulokset ilmaistaan AChE-aktiivisuuden prosentteina HUVEC-soluissa, joita oli käsitelty kahdella DEET-pitoisuudella, verrattuna vehikkelikäsiteltyihin soluihin. Arvot ilmaistaan kuuden riippumattoman kokeen keskiarvona ± SEM. *p < 0,05 verrattuna kontrolliin (Kruskal-Wallis ja Dunn -monivertailutesti).
Typpioksidi (NO) osallistuu angiogeeniseen prosessiin33, joten NO-tuotantoa tutkittiin DEET-stimuloiduissa HUVEC-soluissa. DEET-käsitelty endoteeli-NO-tuotanto lisääntyi verrattuna kontrollisoluihin, mutta saavutti merkitsevän eron vasta annoksella 10-8 M (kuva 3c). DEET-indusoitua NO-tuotantoa säätelevien molekyylitason muutosten määrittämiseksi analysoitiin eNOS:n ilmentymistä ja aktivaatiota Western blot -menetelmällä. Vaikka DEET-käsittely ei muuttanut eNOS:n ilmentymistä, se lisäsi merkittävästi eNOS:n fosforylaatiota sen aktivointikohdassa (Ser-1177) ja samalla vähensi sen inhiboivaa kohtaa (Thr-495) verrattuna käsittelemättömiin soluihin eNOS:n fosforylaatiossa (kuva 3d). Lisäksi fosforyloitujen eNOS:n suhde aktivointikohdassa ja inhiboivassa kohdassa laskettiin sen jälkeen, kun fosforyloidun eNOS:n määrä oli normalisoitu entsyymin kokonaismäärään. Tämä suhde kasvoi merkittävästi HUVEC-soluissa, joita käsiteltiin kullakin DEET-pitoisuudella verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuva 3d).
Lopuksi analysoitiin VEGF:n, yhden tärkeimmistä angiogeneesiä edistävistä tekijöistä, ilmentymistä Western blot -menetelmällä. DEET lisäsi merkittävästi VEGF:n ilmentymistä, kun taas pFHHSiD esti tämän ilmentymisen kokonaan.
Koska DEET:n vaikutukset ovat herkkiä sekä M3-reseptorien farmakologiselle estolle että niiden alasäänelle, testasimme hypoteesia, jonka mukaan DEET saattaisi tehostaa kalsiumsignalointia. Yllättäen DEET ei lisännyt sytoplasmisen kalsiumin määrää HUVEC-soluissa (tietoja ei esitetty) eikä HEK/M3-soluissa (kuva 4a, b) kummallakaan käytetyllä pitoisuudella.
Julkaisun aika: 30.12.2024