Tässä tutkimuksessa yhdistelmähoidon stimuloivat vaikutuksetkasvien kasvunsäätelijät(2,4-D ja kinetiini) ja rautaoksidinanopartikkelien (Fe₃O₄-NP) vaikutusta in vitro -morfogeneesiin ja sekundaaristen metaboliittien tuotantoon *Hypericum perforatum* L.:ssä tutkittiin. Optimoitu käsittely [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetiini (2 mg/l) + Fe₃O₄-NP (4 mg/l)] paransi merkittävästi kasvien kasvuparametreja: kasvien korkeus kasvoi 59,6 %, juurien pituus 114,0 %, silmujen lukumäärä 180,0 % ja kalluksen tuorepaino 198,3 % verrattuna kontrolliryhmään. Tämä yhdistelmäkäsittely paransi myös regeneraatiotehokkuutta (50,85 %) ja lisäsi hyperisiinipitoisuutta 66,6 %. GC-MS-analyysi paljasti korkeita hyperosidin, β-patoleenin ja setyylialkoholin pitoisuuksia, jotka kattavat 93,36 % piikin kokonaispinta-alasta, kun taas fenolien ja flavonoidien kokonaispitoisuudet nousivat jopa 80,1 %. Nämä tulokset osoittavat, että kasvien kasvua säätelevät aineet (PGR) ja Fe₃O₄-nanohiukkaset (Fe₃O₄-NP:t) vaikuttavat synergistisesti stimuloimalla organogeneesiä ja bioaktiivisten yhdisteiden kertymistä, mikä edustaa lupaavaa strategiaa lääkekasvien bioteknologiselle parantamiselle.
Mäkikuisma (Hypericum perforatum L.), joka tunnetaan myös nimellä mäkikuisma, on monivuotinen Hypericaceae-heimoon kuuluva ruohokasvi, jolla on taloudellista arvoa.[1] Sen potentiaalisia bioaktiivisia komponentteja ovat luonnolliset tanniinit, ksantonit, floroglusinoli, naftaleenidiaani (hyperiini ja pseudohyperiini), flavonoidit, fenolihapot ja eteeriset öljyt.[2,3,4] Mäkikuismaa voidaan lisätä perinteisin menetelmin; perinteisten menetelmien kausiluonteisuus, alhainen siementen itävyys ja alttius sairauksille kuitenkin rajoittavat sen mahdollisuuksia laajamittaiseen viljelyyn ja jatkuvaan sekundaaristen metaboliittien muodostumiseen.[1,5,6]
Siksi in vitro -kudosviljelyä pidetään tehokkaana menetelmänä kasvien nopeaan lisäämiseen, sukusolujen säilyttämiseen ja lääkeaineiden saannon lisäämiseen [7, 8]. Kasvunsäätelyaineilla (PGR) on ratkaiseva rooli morfogeneesin säätelyssä, ja ne ovat välttämättömiä kalluksen ja kokonaisten organismien in vitro -viljelylle. Niiden pitoisuuksien ja yhdistelmien optimointi on ratkaisevan tärkeää näiden kehitysprosessien onnistuneelle loppuun saattamiselle [9]. Siksi säätelyaineiden sopivan koostumuksen ja pitoisuuden ymmärtäminen on tärkeää mäkikuisman (H. perforatum) kasvun ja uusiutumiskyvyn parantamiseksi [10].
Rautaoksidinanopartikkelit (Fe₃O₄) ovat nanopartikkelien luokka, joita on kehitetty tai kehitetään parhaillaan kudosviljelyä varten. Fe₃O₂:lla on merkittäviä magneettisia ominaisuuksia, hyvä bioyhteensopivuus ja kyky edistää kasvien kasvua ja vähentää ympäristöstressiä, joten se on herättänyt huomattavaa huomiota kudosviljelysuunnittelussa. Näiden nanopartikkelien potentiaalisia sovelluksia voivat olla in vitro -viljelyn optimointi solujen jakautumisen edistämiseksi, ravinteiden oton parantamiseksi ja antioksidanttientsyymien aktivoimiseksi [11].
Vaikka nanopartikkeleilla on osoitettu olevan hyviä vaikutuksia kasvien kasvuun, tutkimukset Fe₃O₄-nanohiukkasten ja optimoitujen kasvunsäätelijöiden yhteiskäytöstä *H. perforatum*:ssa ovat edelleen niukkoja. Tämän tietämysaukon täyttämiseksi tässä tutkimuksessa arvioitiin niiden yhdistettyjen vaikutusten vaikutuksia in vitro -morfogeneesiin ja sekundaaristen metaboliittien tuotantoon, jotta saatiin uusia näkemyksiä lääkekasvien ominaisuuksien parantamiseksi. Siksi tällä tutkimuksella on kaksi tavoitetta: (1) optimoida kasvien kasvunsäätelijöiden pitoisuus kalluksen muodostumisen, versojen uudistumisen ja juurtumisen tehokkaaksi edistämiseksi in vitro; ja (2) arvioida Fe₃O₄-nanohiukkasten vaikutuksia kasvuparametreihin in vitro. Tulevaisuuden suunnitelmiin kuuluu regeneroituneiden kasvien selviytymisasteen arviointi sopeutumisen aikana (in vitro). Tämän tutkimuksen tulosten odotetaan parantavan merkittävästi *H. perforatum*:n mikrolisäystehokkuutta, mikä edistää tämän tärkeän lääkekasvin kestävää käyttöä ja bioteknologisia sovelluksia.
Tässä tutkimuksessa hankimme lehtikasveja pellolla kasvatetuista yksivuotisista mäkikuismakasveista (emokasveista). Näitä lehtikasveja käytettiin in vitro -viljelyolosuhteiden optimointiin. Ennen viljelyä lehdet huuhdeltiin huolellisesti juoksevan tislatun veden alla useiden minuuttien ajan. Sitten lehtikasvien pinnat desinfioitiin upottamalla ne 70-prosenttiseen etanoliin 30 sekunniksi ja sen jälkeen upottamalla ne 1,5-prosenttiseen natriumhypokloriittiliuokseen (NaOCl), joka sisälsi muutaman tipan Tween 20:tä, 10 minuutiksi. Lopuksi lehtikasvit huuhdeltiin kolme kertaa steriilillä tislatulla vedellä ennen siirtämistä seuraavaan viljelyalustaan.
Seuraavien neljän viikon aikana mitattiin versojen uudistumisparametreja, mukaan lukien uudistumisnopeus, versojen lukumäärä tainta kohden ja verson pituus. Kun uudistuneet versot saavuttivat vähintään 2 cm:n pituuden, ne siirrettiin juurtumisalustalle, joka koostui puolivahvasta MS-alustasta, 0,5 mg/l indolivoihappoa (IBA) ja 0,3 % guarkumia. Juurrutusviljelyä jatkettiin kolme viikkoa, jonka aikana mitattiin juurtumisnopeus, juurien lukumäärä ja juurien pituus. Jokainen käsittely toistettiin kolme kertaa, ja 10 tainta viljeltiin toistoa kohden, jolloin saatiin noin 30 tainta käsittelyä kohden.
Kasvin korkeus mitattiin senttimetreinä (cm) viivaimella kasvin tyvestä korkeimman lehden kärkeen. Juuren pituus mitattiin millimetreinä (mm) heti taimien huolellisen poistamisen ja kasvualustaa poistamisen jälkeen. Silmujen lukumäärä tainta kohden laskettiin suoraan jokaisesta kasvista. Lehtien mustien täplien, eli kyhmyjen, lukumäärä mitattiin silmämääräisesti. Näiden mustien kyhmyjen uskotaan olevan hyperisiiniä sisältäviä rauhasia eli oksidatiivisia täpliä, ja niitä käytetään fysiologisena indikaattorina kasvin vasteesta käsittelyyn. Kun kaikki kasvualusta oli poistettu, taimien tuorepaino mitattiin elektronisella vaa'alla milligramman (mg) tarkkuudella.
Kalluksen muodostumisnopeus lasketaan seuraavasti: kun eksplantteja on viljelty neljän viikon ajan kasvua sääteleviä aineita (kinaaseja, 2,4-D:tä ja Fe3O4:ää) sisältävässä elatusaineessa, lasketaan kallusta muodostamaan kykenevien eksplanttien lukumäärä. Kalluksen muodostumisnopeus lasketaan seuraavalla kaavalla:
Jokainen käsittely toistettiin kolme kertaa, ja jokaisella toistolla tutkittiin vähintään 10 eksplantaattia.
Uudistumisnopeus heijastaa sitä kalluskudoksen osuutta, joka onnistuneesti suorittaa loppuun silmujen erilaistumisprosessin kalluksen muodostumisvaiheen jälkeen. Tämä indikaattori osoittaa kalluksen kyvyn muuntua erilaistuneeksi kudokseksi ja kasvaa uusiksi kasvielimiksi.
Juurtumiskerroin on juurtumiseen kykenevien oksien lukumäärän suhde oksien kokonaismäärään. Tämä indikaattori heijastaa juurtumisvaiheen onnistumista, mikä on ratkaisevan tärkeää mikrolisäyksessä ja kasvien lisäyksessä, sillä hyvä juurtuminen auttaa taimia selviytymään paremmin kasvuolosuhteissa.
Hyperisiiniyhdisteet uutettiin 90-prosenttisella metanolilla. Viisikymmentä mg kuivattua kasvimateriaalia lisättiin 1 ml:aan metanolia ja sonikoitiin 20 minuuttia 30 kHz:n taajuudella ultraäänipuhdistimessa (malli A5120-3YJ) huoneenlämmössä pimeässä. Sonikoinnin jälkeen näyte sentrifugoitiin nopeudella 6000 rpm 15 minuuttia. Supernatantti kerättiin ja hyperisiinin absorbanssi mitattiin 592 nm:ssä käyttäen Plus-3000 S -spektrofotometriä Conceiçao et al. [14] kuvaaman menetelmän mukaisesti.
Useimmat käsittelyt kasvunsäätelyaineilla (PGR) ja rautaoksidinanopartikkeleilla (Fe₃O₄-NP) eivät aiheuttaneet mustien kyhmyjen muodostumista regeneroituneisiin versonlehtiin. Kyhmyjä ei havaittu missään käsittelyissä, joissa käytettiin 0,5 tai 1 mg/l 2,4-D:tä, 0,5 tai 1 mg/l kinetiiniä tai 1, 2 tai 4 mg/l rautaoksidinanopartikkeleita. Muutamat yhdistelmät osoittivat lievää kyhmyjen kehittymisen lisääntymistä (mutta ei tilastollisesti merkitsevää) suuremmilla kinetiini- ja/tai rautaoksidinanopartikkelipitoisuuksilla, kuten 2,4-D:n (0,5–2 mg/l) yhdistelmä kinetiinin (1–1,5 mg/l) ja rautaoksidinanopartikkeleiden (2–4 mg/l) kanssa. Nämä tulokset on esitetty kuvassa 2. Mustat kyhmyt edustavat hyperisiinirikkaita rauhasia, jotka ovat sekä luonnostaan esiintyviä että hyödyllisiä. Tässä tutkimuksessa mustat kyhmyt liittyivät pääasiassa kudosten ruskistumiseen, mikä viittaa suotuisaan ympäristöön hyperisiinin kertymiselle. Käsittely 2,4-D:llä, kinetiinillä ja Fe₃O₄-nanopartikkeleilla edisti kalluksen kasvua, vähensi ruskistumista ja lisäsi klorofyllipitoisuutta, mikä viittaa parantuneeseen aineenvaihduntaan ja oksidatiivisten vaurioiden mahdolliseen vähenemiseen [37]. Tässä tutkimuksessa arvioitiin kinetiinin vaikutuksia yhdessä 2,4-D:n ja Fe₃O₄-nanopartikkelien kanssa mäkikuisman kalluksen kasvuun ja kehitykseen (kuva 3a–g). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että Fe₃O₄-nanopartikkeleilla on sieni- ja mikrobilääkkeitä [38, 39], ja yhdessä kasvien kasvunsäätelijöiden kanssa ne voivat stimuloida kasvien puolustusmekanismeja ja vähentää solujen stressi-indeksejä [18]. Vaikka sekundaaristen metaboliittien biosynteesi on geneettisesti säädeltyä, niiden todellinen saanto riippuu suuresti ympäristöolosuhteista. Aineenvaihdunta- ja morfologiset muutokset voivat vaikuttaa sekundaaristen metaboliittien tasoihin säätelemällä tiettyjen kasvigeenien ilmentymistä ja reagoimalla ympäristötekijöihin. Lisäksi indusoijat voivat laukaista uusien geenien aktivoitumisen, mikä puolestaan stimuloi entsymaattista aktiivisuutta, lopulta aktivoiden useita biosynteesireittejä ja johtaen sekundaaristen metaboliittien muodostumiseen. Lisäksi eräässä toisessa tutkimuksessa osoitettiin, että varjostuksen vähentäminen lisää auringonvalolle altistumista, mikä nostaa päiväaikaisia lämpötiloja *Hypericum perforatum* -lajin luonnollisessa elinympäristössä, mikä myös osaltaan lisää hyperisiinin saantoa. Näiden tietojen perusteella tässä tutkimuksessa tutkittiin rautananohiukkasten roolia potentiaalisina indusoijina kudosviljelmässä. Tulokset osoittivat, että nämä nanohiukkaset voivat aktivoida hesperidiinin biosynteesiin osallistuvia geenejä entsymaattisen stimulaation kautta, mikä johtaa tämän yhdisteen lisääntyneeseen kertymiseen (kuva 2). Siksi voidaan väittää, että verrattuna luonnonolosuhteissa kasvaviin kasveihin, tällaisten yhdisteiden tuotantoa in vivo voidaan myös tehostaa, kun kohtalainen stressi yhdistetään sekundaaristen metaboliittien biosynteesiin osallistuvien geenien aktivointiin. Yhdistelmäkäsittelyillä on yleensä positiivinen vaikutus regeneraationopeuteen, mutta joissakin tapauksissa tämä vaikutus heikkenee. Erityisesti käsittely 1 mg/l 2,4-D:llä, 1,5 mg/l kinaasilla ja eri pitoisuuksilla voi itsenäisesti ja merkittävästi lisätä regeneraationopeutta 50,85 % verrattuna kontrolliryhmään (kuva 4c). Nämä tulokset viittaavat siihen, että tietyt nanohormonien yhdistelmät voivat toimia synergistisesti edistäen kasvien kasvua ja metaboliittien tuotantoa, millä on suuri merkitys lääkekasvien kudosviljelylle. Palmer ja Keller [50] osoittivat, että 2,4-D-käsittely voi itsenäisesti indusoida kalluksen muodostumista St. perforatumissa, kun taas kinaasin lisääminen tehosti merkittävästi kalluksen muodostumista ja uudistumista. Tämä vaikutus johtui hormonitasapainon paranemisesta ja solujen jakautumisen stimuloitumisesta. Bal ym. [51] havaitsivat, että Fe₃O₄-NP-käsittely voi itsenäisesti tehostaa antioksidanttientsyymien toimintaa, mikä edistää juurien kasvua St. perforatumissa. Viljelyalustat, jotka sisälsivät Fe₃O₄-nanohiukkasia pitoisuuksina 0,5 mg/l, 1 mg/l ja 1,5 mg/l, paransivat pellavakasvien uudistumisnopeutta [52]. Kinetiinin, 2,4-diklooribentsotiatsolinonin ja Fe₃O₄-nanohiukkasten käyttö paransi merkittävästi kalluksen ja juurien muodostumisnopeutta, mutta näiden hormonien käytön mahdolliset sivuvaikutukset in vitro -uudistuksessa on otettava huomioon. Esimerkiksi 2,4-diklooribentsotiatsolinonin tai kinetiinin pitkäaikainen tai suuri pitoisuus voi johtaa somaattiseen klonaaliseen vaihteluun, oksidatiiviseen stressiin, epänormaaliin kalluksen morfologiaan tai lasittumiseen. Siksi korkea regeneraationopeus ei välttämättä ennusta geneettistä vakautta. Kaikki regeneroidut kasvit tulisi arvioida molekyylimarkkereilla (esim. RAPD, ISSR, AFLP) tai sytogeneettisellä analyysillä niiden homogeenisuuden ja samankaltaisuuden in vivo -kasvien kanssa määrittämiseksi [53,54,55].
Tämä tutkimus osoitti ensimmäistä kertaa, että kasvien kasvunsäätelijöiden (2,4-D ja kinetiini) yhdistetty käyttö Fe₃O₄-nanohiukkasten kanssa voi parantaa morfogeneesiä ja keskeisten bioaktiivisten metaboliittien (mukaan lukien hyperisiini ja hyperosidi) kertymistä *Hypericum perforatum* -kasvissa. Optimoitu hoito-ohjelma (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetiini + 4 mg/l Fe₃O₄-nanopartikkeleita) ei ainoastaan maksimoinut kalluksen muodostumista, organogeneesiä ja sekundaaristen metaboliittien saantoa, vaan sillä oli myös lievä indusoiva vaikutus, joka voi parantaa kasvin stressinsietokykyä ja lääkinnällistä arvoa. Nanoteknologian ja kasvikudosviljelyn yhdistelmä tarjoaa kestävän ja tehokkaan alustan lääkeyhdisteiden laajamittaiselle in vitro -tuotannolle. Nämä tulokset tasoittavat tietä teollisille sovelluksille ja tulevalle tutkimukselle molekyylimekanismeista, annostuksen optimoinnista ja geneettisestä tarkkuudesta, yhdistäen siten lääkekasvien perustutkimuksen käytännön bioteknologiaan.
Julkaisun aika: 12.12.2025