Verson apikaalisen meristeemin (SAM) kasvu on kriittistä varren rakenteelle.gibberelliinit(GA)-entsyymit (GA) ovat avainasemassa kasvien kasvun koordinoinnissa, mutta niiden rooli soluvälitteisessä peptidijärjestelmässä (SAM) on edelleen huonosti ymmärretty. Tässä tutkimuksessa kehitimme ratiometrisen GA-signaloinnin biosensorin muokkaamalla DELLA-proteiinia tukahduttamaan sen keskeisen säätelytehtävän GA-transkriptionaalisessa vasteessa samalla, kun se säilyttää sen hajoamisen GA-tunnistuksen yhteydessä. Osoitamme, että tämä hajoamiseen perustuva biosensori tallentaa tarkasti GA-tasojen ja solujen aistimisen muutokset kehityksen aikana. Käytimme tätä biosensoria GA-signalointiaktiivisuuden kartoittamiseen SAM:ssa. Osoitamme, että voimakkaita GA-signaaleja on pääasiassa soluissa, jotka sijaitsevat elinalkujen välissä, jotka ovat internodesolujen esiasteita. Käyttämällä toiminnan lisäys- ja menetysmenetelmiä osoitamme edelleen, että GA säätelee solunjakautumistason orientaatiota, muodostaen internodien kanonisen soluorganisaation ja edistäen siten internodespesifikaatiota SAM:ssa.
Verson kärjessä sijaitseva verson apikaalinen meristeemi (SAM) sisältää joukon kantasoluja, joiden toiminta tuottaa sivuelimiä ja varren solmukkeita modulaarisella ja iteratiivisella tavalla koko kasvin elinkaaren ajan. Jokainen näistä toistuvista yksiköistä eli kasvisolmukkeista sisältää internodit ja sivuelimet solmukohdissa sekä kainalomeristeemit lehtien kainaloissa1. Kasvisolmukkeiden kasvu ja organisaatio muuttuvat kehityksen aikana. Arabidopsisilla internodikasvu hidastuu vegetatiivisen vaiheen aikana, ja kainalomeristeemit pysyvät lepotilassa ruusukelehtien kainaloissa. Kukintavaiheeseen siirtymisen aikana SAM:sta tulee kukintomeristeemi, joka tuottaa pitkänomaisia internodit ja kainalosilmuja, oksia kukkalehtien kainaloissa ja myöhemmin lehdettömiä kukkia2. Vaikka olemme edistyneet merkittävästi lehtien, kukkien ja haarojen muodostumisen alkamista säätelevien mekanismien ymmärtämisessä, internodien syntymisestä tiedetään suhteellisen vähän.
GA-proteiinien ajallisen ja spatiaalisen jakauman ymmärtäminen auttaa ymmärtämään paremmin näiden hormonien toimintoja eri kudoksissa ja eri kehitysvaiheissa. Oman promoottorinsa vaikutuksesta ilmentyvän RGA-GFP-fuusion hajoamisen visualisointi antaa tärkeää tietoa GA:n kokonaispitoisuuksien säätelystä juurissa15,16. RGA:n ilmentyminen vaihtelee kuitenkin kudoksissa17 ja sitä säätelee GA18. Siten RGA-promoottorin erilainen ilmentyminen voi johtaa RGA-GFP:llä havaittuun fluoresenssikuvioon, joten tämä menetelmä ei ole kvantitatiivinen. Äskettäin bioaktiivisella fluoreseiinilla (Fl) leimattu GA19,20 paljasti GA:n kertymisen juuren endokorteksiin ja sen solutasojen säätelyn GA-kuljetuksen avulla. Äskettäin GA FRET -anturi nlsGPS1 osoitti, että GA-tasot korreloivat solujen pidentymisen kanssa juurissa, filamenteissa ja pimeässä kasvaneissa hypokotyyleissä21. Kuten olemme kuitenkin nähneet, GA-pitoisuus ei ole ainoa GA-signalointiaktiivisuutta säätelevä parametri, koska se riippuu monimutkaisista aistimisprosesseista. Tässä työssä, DELLA- ja GA-signalointireittien tuntemuksemme pohjalta, raportoimme hajoamiseen perustuvan ratiometrisen GA-signaloinnin biosensorin kehittämisestä ja karakterisoinnista. Tämän kvantitatiivisen biosensorin kehittämiseksi käytimme mutanttia, GA-herkkää RGA:ta, joka oli fuusioitu fluoresoivaan proteiiniin ja ilmentyi kaikkialla kudoksissa, sekä GA-insensitiivistä fluoresoivaa proteiinia. Osoitamme, että mutantti-RGA-proteiinifuusiot eivät häiritse endogeenistä GA-signalointia, kun niitä ilmennetään kaikkialla, ja että tämä biosensori pystyy kvantifioimaan sekä GA-syötteestä että anturilaitteen GA-signaalinkäsittelystä johtuvaa signalointiaktiivisuutta suurella spatiaalisella ja ajallisella resoluutiolla. Käytimme tätä biosensoria kartoittaaksemme GA-signalointiaktiivisuuden spatiaalisessa jakaumassa ja kvantifioidaksemme, miten GA säätelee solujen käyttäytymistä SAM-epidermissä. Osoitamme, että GA säätelee elinalkuaineiden välissä sijaitsevien SAM-solujen jakautumistasojen orientaatiota, määritteleen siten internodin kanonisen soluorganisaation.
Lopuksi kysyimme, voiko qmRGA raportoida muutoksia endogeenisen GA-pitoisuudessa kasvavia hypokotyylejä käytettäessä. Olemme aiemmin osoittaneet, että nitraatti stimuloi kasvua lisäämällä GA-synteesiä ja sitä kautta DELLA34:n hajoamista. Vastaavasti havaitsimme, että hypokotyylin pituus pUBQ10::qmRGA-taimissa, joita kasvatettiin runsaalla nitraatin saannilla (10 mM NO3−), oli merkittävästi pidempi kuin nitraatinpuutteisissa olosuhteissa kasvatettujen taimien taimien (lisäkuva 6a). Kasvuvasteen mukaisesti GA-signaalit olivat korkeampia 10 mM NO3− -olosuhteissa kasvatettujen taimien hypokotyyleissä kuin ilman nitraattia kasvatettujen taimien taimissa (lisäkuva 6b, c). Siten qmRGA mahdollistaa myös endogeenisten GA-pitoisuuden muutosten aiheuttamien GA-signaloinnin muutosten seurannan.
Ymmärtääksemme, riippuuko qmRGA:n havaitsema GA-signalointiaktiivisuus GA-pitoisuudesta ja GA-havainnosta, kuten anturirakenteen perusteella odotettiin, analysoimme kolmen GID1-reseptorin ilmentymistä vegetatiivisissa ja lisääntymiskudoksissa. Taimissa GID1-GUS-reportterilinja osoitti, että GID1a:ta ja c:tä ilmentyi runsaasti sirkkalehdissä (kuva 3a–c). Lisäksi kaikkia kolmea reseptoria ilmentyi lehdissä, sivujuurten alkiosoluissa, juurenkärjissä (paitsi GID1b:n juurenlakalla) ja verisuonistossa (kuva 3a–c). Kukinnon itsepintaisessa solukalvossa (SAM) havaitsimme GUS-signaaleja vain GID1b:lle ja 1c:lle (lisäkuva 7a–c). In situ -hybridisaatio vahvisti nämä ilmentymismallit ja osoitti edelleen, että GID1c:tä ilmentyi tasaisesti matalilla tasoilla SAM:ssa, kun taas GID1b:n ilmentyminen oli suurempaa SAM:n reuna-alueilla (lisäkuva 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b-translaatiofuusio paljasti myös GID1b:n ilmentymisen porrastetun vaihteluvälin, matalasta tai ei lainkaan ilmentymistä SAM:n keskellä korkeaan ilmentymiseen elinten reunoilla (lisäkuva 7m). Siten GID1-reseptorit eivät ole tasaisesti jakautuneet kudoksiin ja niiden sisällä. Myöhemmissä kokeissa havaitsimme myös, että GID1:n (pUBQ10::GID1a-mCherry) yliekspressio lisäsi qmRGA:n herkkyyttä hypokotyyleissä ulkoiselle GA-käsittelylle (kuva 3d, e). Sitä vastoin qd17mRGA:lla hypokotyylissä mitattu fluoresenssi ei ollut herkkä GA3-käsittelylle (kuva 3f, g). Molemmissa määrityksissä taimia käsiteltiin suurilla GA-pitoisuuksilla (100 μM GA3) anturin nopean käyttäytymisen arvioimiseksi, jossa kyky sitoutua GID1-reseptoriin tehostui tai hävisi. Nämä tulokset yhdessä vahvistavat, että qmRGA-biosensori toimii yhdistettynä GA- ja GA-sensorina, ja viittaavat siihen, että GID1-reseptorin erilainen ilmentyminen voi merkittävästi moduloida sensorin emissiivisyyttä.
Tähän mennessä GA-signaalien jakauma SAM:ssa on edelleen epäselvä. Siksi käytimme qmRGA:ta ilmentäviä kasveja ja pCLV3::mCherry-NLS-kantasolureportteria35 laskeaksemme GA-signalointiaktiivisuuten korkearesoluutioisia kvantitatiivisia karttoja keskittyen L1-kerrokseen (epidermis; kuva 4a, b, katso menetelmät ja lisämenetelmät), koska L1:llä on keskeinen rooli SAM:n kasvun säätelyssä36. Tässä pCLV3::mCherry-NLS:n ilmentyminen tarjosi kiinteän geometrisen viitepisteen GA-signalointiaktiivisuuden spatiotemporaalisen jakauman analysointiin37. Vaikka GA:ta pidetään välttämättömänä sivuelinten kehitykselle4, havaitsimme, että GA-signaalit olivat alhaisia kukka-alkuvaiheessa (P) P3-vaiheesta alkaen (kuva 4a, b), kun taas nuorilla P1- ja P2-alkuvaiheilla oli kohtalaista aktiivisuutta, joka oli samanlainen kuin keskialueella (kuva 4a, b). Korkeampaa GA-signalointiaktiivisuutta havaittiin elinten alkusolujen rajoilla, alkaen P1/P2-kerroksista (rajan sivuilla) ja saavuttaen huippunsa P4-kerroksessa, sekä kaikissa alkusolujen välissä sijaitsevien perifeeristen alueiden soluissa (kuva 4a, b ja lisäkuva 8a, b). Tätä korkeampaa GA-signalointiaktiivisuutta havaittiin paitsi epidermiksessä myös L2- ja ylemmissä L3-kerroksissa (lisäkuva 8b). Myös qmRGA:lla SAM:ssa havaittujen GA-signaalien kuvio pysyi muuttumattomana ajan kuluessa (lisäkuva 8c–f, k). Vaikka qd17mRGA-konstrukti ilmentyi systemaattisesti alaspäin viiden riippumattoman linjan T3-kasvien SAM:issa, joita karakterisoimme yksityiskohtaisesti, pystyimme analysoimaan pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruktilla saatuja fluoresenssikuvioita (lisäkuva 8g–j, l). Tässä kontrollilinjassa havaittiin vain pieniä muutoksia fluoresenssisuhteessa SAM:ssa, mutta SAM-keskuksessa havaitsimme selkeän ja odottamattoman TagBFP:hen liittyvän VENUS:n vähenemisen. Tämä vahvistaa, että qmRGA:n havaitsema signalointikuvio heijastaa mRGA-VENUSin GA-riippuvaista hajoamista, mutta osoittaa myös, että qmRGA saattaa yliarvioida GA-signalointiaktiivisuutta meristeemikeskuksessa. Yhteenvetona voidaan todeta, että tuloksemme paljastavat GA-signalointikuvion, joka heijastaa ensisijaisesti primordioiden jakautumista. Tämä primaarien välisen alueen (IPR) jakautuminen johtuu korkean GA-signalointiaktiivisuuden asteittaisesta muodostumisesta kehittyvän primordiumin ja keskusalueen välille, kun taas samaan aikaan GA-signalointiaktiivisuus primordiumissa vähenee (kuva 4c, d).
GID1b- ja GID1c-reseptorien jakauma (katso yllä) viittaa siihen, että GA-reseptorien erilainen ilmentyminen auttaa muokkaamaan GA-signalointiaktiivisuuden kuviota SAM:ssa. Pohdimme, voisiko GA:n erilainen kertyminen olla osallisena. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi käytimme nlsGPS1 GA FRET -sensoria21. 100 minuutin ajan 10 μM GA4+7:llä käsitellyn nlsGPS1:n SAM:ssa havaittiin lisääntynyt aktivaatiotaajuus (lisäkuva 9a–e), mikä osoittaa, että nlsGPS1 reagoi GA-pitoisuuden muutoksiin SAM:ssa, kuten se tekee juurissa21. nlsGPS1:n aktivaatiotaajuuden spatiaalinen jakauma paljasti suhteellisen alhaiset GA-tasot SAM:n ulkokerroksissa, mutta osoitti, että ne olivat koholla SAM:n keskellä ja reunoilla (kuva 4e ja lisäkuva 9a, c). Tämä viittaa siihen, että GA on myös jakautunut SAM:iin spatiaalisella kuviolla, joka on verrattavissa qmRGA:n paljastamaan kuvioon. Täydentävänä lähestymistapana käsittelimme SAM-soluja myös fluoresoivalla GA:lla (GA3-, GA4-, GA7-Fl) tai pelkällä Fl:llä negatiivisena kontrollina. Fl-signaali jakautui koko SAM-soluihin, mukaan lukien keskialue ja alkukudos, vaikkakin alhaisemmalla intensiteetillä (kuva 4j ja lisäkuva 10d). Sitä vastoin kaikki kolme GA-Fl:ää kertyivät spesifisesti alkukudoksen rajoihin ja vaihtelevassa määrin muualle IPR-soluihin, GA7-Fl:n kertyessä IPR:n suurimpaan domeeniin (kuva 4k ja lisäkuva 10a,b). Fluoresenssin intensiteetin kvantifiointi paljasti, että IPR:n ja ei-IPR:n intensiteettisuhde oli korkeampi GA-Fl:llä käsitellyssä SAM-soluissa verrattuna Fl:llä käsiteltyyn SAM-soluihin (kuva 4l ja lisäkuva 10c). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että GA:ta on läsnä suurempina pitoisuuksina IPR-soluissa, jotka sijaitsevat lähimpänä elinreunaa. Tämä viittaa siihen, että SAM-GA-signalointiaktiivisuuden kuvio johtuu sekä GA-reseptorien erilaisesta ilmentymisestä että GA:n erilaisesta kertymisestä IPR-soluihin elinreunojen lähellä. Analyysimme paljasti siis odottamattoman GA-signaloinnin spatiotemporaalisen kuvion, jossa aktiivisuus oli alhaisempi SAM:n keskellä ja alkulohkossa ja aktiivisuus korkeampi IPR:ssä perifeerisellä alueella.
Ymmärtääksemme differentiaalisen GA-signalointiaktiivisuuden roolia SAM-soluissa analysoimme GA-signalointiaktiivisuuden, solujen laajenemisen ja solujen jakautumisen välistä korrelaatiota käyttämällä SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS -plasmidin reaaliaikaista aikaviivekuvausta. Koska GA:lla on rooli kasvun säätelyssä, odotettiin positiivista korrelaatiota solujen laajenemisparametrien kanssa. Siksi vertasimme ensin GA-signalointiaktiivisuuskarttoja solujen pinnan kasvunopeuskarttoihin (solulaajenemisen voimakkuuden sijaisina tietylle solulle ja tytärsoluille jakautumisen yhteydessä) ja kasvuanisotropiakarttoihin, jotka mittaavat solujen laajenemisen suuntaa (käytetään myös tässä tietylle solulle ja tytärsoluille jakautumisen yhteydessä; kuva 5a, b, katso menetelmät ja lisämenetelmät). SAM-solujen pinnan kasvunopeuskarttamme ovat yhdenmukaisia aiempien havaintojen38,39 kanssa, ja niissä kasvunopeudet reunalla ovat minimaaliset ja kehittyvissä kukissa maksimaaliset (kuva 5a). Pääkomponenttianalyysi (PCA) osoitti, että GA-signalointiaktiivisuus korreloi negatiivisesti solujen pinnan kasvuintensiteetin kanssa (kuva 5c). Osoitimme myös, että variaation pääakselit, mukaan lukien GA-signaloinnin sisääntulo ja kasvun intensiteetti, olivat ortogonaalisia korkean CLV3-ekspression määräämään suuntaan nähden, mikä vahvisti solujen poissulkemisen SAM-keskuksesta jäljellä olevissa analyyseissä. Spearmanin korrelaatioanalyysi vahvisti PCA-tulokset (kuva 5d) ja osoitti, että korkeammat GA-signaalit IPR:ssä eivät johtaneet korkeampaan solujen laajenemiseen. Korrelaatioanalyysi kuitenkin paljasti lievän positiivisen korrelaation GA-signalointiaktiivisuuden ja kasvuanisotropian välillä (kuva 5c, d), mikä viittaa siihen, että korkeampi GA-signalointi IPR:ssä vaikuttaa solujen kasvusuuntaan ja mahdollisesti solujen jakautumistasoon.
a, b Keskimääräisen pintakasvun (a) ja kasvuanisotropian (b) lämpökartat SAM-soluissa laskettuna seitsemän riippumattoman kasvin keskiarvoina (käytettiin solujen laajenemisen voimakkuuden ja suunnan estimina). c PCA-analyysi sisälsi seuraavat muuttujat: GA-signaali, pintakasvun intensiteetti, pintakasvun anisotropia ja CLV3-ilmentyminen. PCA-komponentti 1 korreloi pääasiassa negatiivisesti pintakasvun intensiteetin kanssa ja positiivisesti GA-signaalin kanssa. PCA-komponentti 2 korreloi pääasiassa positiivisesti pintakasvun anisotropian kanssa ja negatiivisesti CLV3-ilmentymisen kanssa. Prosenttiosuudet edustavat kunkin komponentin selittämää vaihtelua. d Spearmanin korrelaatioanalyysi GA-signaalin, pintakasvun intensiteetin ja pintakasvun anisotropian välillä kudostasolla lukuun ottamatta CZ:tä. Oikealla oleva numero on Spearmanin rho-arvo kahden muuttujan välillä. Asteriskit osoittavat tapauksia, joissa korrelaatio/negatiivinen korrelaatio on erittäin merkittävä. e Col-0 SAM L1 -solujen 3D-visualisointi konfokaalimikroskopialla. SAM-soluihin (mutta ei alkusoluun) 10 tunnissa muodostuneet uudet soluseinät on väritetty niiden kulma-arvojen mukaan. Väripalkki näkyy oikeassa alakulmassa. Pienempi kuva näyttää vastaavan 3D-kuvan kohdassa 0 h. Koe toistettiin kahdesti, ja tulokset olivat samankaltaisia. f Laatikkodiagrammit näyttävät solujen jakautumisnopeudet IPR- ja ei-IPR-Col-0 SAM-kasveissa (n = 10 itsenäistä kasvia). Keskiviiva näyttää mediaanin ja laatikon reunat osoittavat 25. ja 75. persentiilin. Viikset osoittavat R-ohjelmistolla määritetyt minimi- ja maksimiarvot. P-arvot saatiin Welchin kaksisuuntaisella t-testillä. g, h Kaaviokuva, joka näyttää (g) kuinka mitata uuden soluseinän (magenta) kulma SAM-kasvin keskipisteestä säteittäiseen suuntaan nähden (valkoinen katkoviiva) (vain terävät kulman arvot, eli 0–90°, otetaan huomioon), ja (h) meristeemin ympärysmitta-/sivuttais- ja säteittäiset suunnat. i Solunjakautumistason suunnan taajuushistogrammit SAM-kasvin (tummansininen), IPR-kasvin (keskisininen) ja ei-IPR-kasvin (vaaleansininen) poikki. P-arvot saatiin kaksisuuntaisella Kolmogorov-Smirnov-testillä. Koe toistettiin kahdesti, ja tulokset olivat samankaltaisia. j IPR:n solunjakautumistasojen orientaation taajuushistogrammit P3:n (vaaleanvihreä), P4:n (keskivihreä) ja P5:n (tummanvihreä) ympärillä. P-arvot saatiin kaksisuuntaisella Kolmogorov-Smirnov-testillä. Koe toistettiin kahdesti, ja tulokset olivat samankaltaisia.
Siksi tutkimme seuraavaksi GA-signaloinnin ja solujen jakautumisaktiivisuuden välistä korrelaatiota tunnistamalla määrityksen aikana muodostuneita uusia soluseiniä (kuva 5e). Tämä lähestymistapa mahdollisti solujen jakautumisen taajuuden ja suunnan mittaamisen. Yllättäen havaitsimme, että solujen jakautumistiheys IPR:ssä ja muualla SAM:ssa (ei-IPR, kuva 5f) oli samanlainen, mikä osoittaa, että GA-signaloinnin erot IPR- ja ei-IPR-solujen välillä eivät vaikuta merkittävästi solujen jakautumiseen. Tämä ja positiivinen korrelaatio GA-signaloinnin ja kasvuanisotropian välillä saivat meidät pohtimaan, voisiko GA-signalointiaktiivisuus vaikuttaa solujen jakautumistasoon. Mittasimme uuden soluseinän suunnan terävänä kulmana meristeemikeskuksen ja uuden soluseinän keskipisteen yhdistävään säteittäiseen akseliin nähden (kuva 5e-i) ja havaitsimme selkeän taipumuksen solujen jakautumisessa lähes 90°:n kulmissa säteittäiseen akseliin nähden. Suurimmat taajuudet havaittiin 70–80°:n (23,28 %) ja 80–90°:n (22,62 %) kulmissa (kuva 5e,i), mikä vastaa solujen jakautumista kehän suuntaisessa/poikittaissuunnassa (kuva 5h). Tutkiaksemme GA-signaloinnin osuutta tähän solujen jakautumiskäyttäytymiseen analysoimme solujen jakautumisparametreja IPR:ssä ja ei-IPR:ssä erikseen (kuva 5i). Havaitsimme, että jakautumiskulman jakauma IPR-soluissa poikkesi ei-IPR-soluissa tai koko SAM:n soluissa, ja IPR-soluissa havaittiin suurempi osuus lateraalisia/ympyränmuotoisia solujakaumia, eli 70–80° ja 80–90° (33,86 % ja 30,71 % vastaavat osuudet) (kuva 5i). Havaintomme paljastivat siis yhteyden korkean GA-signaloinnin ja kehänsuuntaisen solujakautumistason orientaation välillä, samalla tavalla kuin GA-signalointiaktiivisuuden ja kasvuanisotropian välinen korrelaatio (kuva 5c, d). Tämän yhteyden spatiaalisen säilyvyyden selvittämiseksi mittasimme jakautumistason orientaatiota IPR-soluissa, jotka ympäröivät alkua P3:sta alkaen, koska korkein GA-signalointiaktiivisuus havaittiin tällä alueella P4:stä alkaen (kuva 4). IPR:n jakautumiskulmissa P3:n ja P4:n ympärillä ei ollut tilastollisesti merkitseviä eroja, vaikka lateraalisten solujakautumisten esiintymistiheyden lisääntymistä havaittiin IPR:ssä P4:n ympärillä (kuva 5j). P5:n ympärillä olevissa IPR-soluissa solujen jakautumistasojen orientaation ero kuitenkin muuttui tilastollisesti merkitseväksi, ja poikittaisten solujen jakautumisten taajuus kasvoi jyrkästi (kuva 5j). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että GA-signalointi voi kontrolloida solujen jakautumisten orientaatiota SAM:ssa, mikä on yhdenmukaista aiempien raporttien40,41 kanssa, joiden mukaan korkea GA-signalointi voi indusoida solujen jakautumisten lateraalista orientaatiota IPR:ssä.
On ennustettu, että IPR:n solut eivät liity alkusoluihin, vaan pikemminkin internodeihin2,42,43. Solujen jakautumisten poikittainen suuntautuminen IPR:ssä voi johtaa epidermaalisten solujen tyypilliseen rinnakkaisten pitkittäisten rivien järjestäytymiseen internodeissa. Edellä kuvatut havaintomme viittaavat siihen, että GA-signaloinnilla on todennäköisesti rooli tässä prosessissa säätelemällä solujen jakautumisen suuntaa.
Useiden DELLA-geenien toiminnan menetys johtaa konstitutiiviseen GA-vasteeseen, ja della-mutantteja voidaan käyttää tämän hypoteesin testaamiseen44. Analysoimme ensin viiden DELLA-geenin ilmentymismalleja SAM:ssa. GUS-linjan45 transkriptionaalinen fuusio paljasti, että GAI, RGA, RGL1 ja RGL2 (paljon vähäisemmässä määrin) ilmentyivät SAM:ssa (lisäkuva 11a–d). In situ -hybridisaatio osoitti edelleen, että GAI-mRNA kertyy spesifisesti alkuaikoihin ja kehittyviin kukkiin (lisäkuva 11e). RGL1- ja RGL3-mRNA:ta havaittiin koko SAM-latvustossa ja vanhemmissa kukissa, kun taas RGL2-mRNA:ta oli runsaammin reuna-alueella (lisäkuva 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM:n konfokaalikuvaus vahvisti in situ -hybridisaatiolla havaitun ilmentymisen ja osoitti, että RGL3-proteiini kertyy SAM:n keskiosaan (lisäkuva 11i). Käyttämällä pRGA::GFP-RGA-solulinjaa havaitsimme myös, että RGA-proteiini kertyy SAM-soluihin, mutta sen määrä vähenee rajalla P4:stä alkaen (lisäkuva 11j). Merkillepantavaa on, että RGL3:n ja RGA:n ilmentymismallit ovat yhdenmukaisia qmRGA:lla havaitun IPR:n korkeamman GA-signalointiaktiivisuuden kanssa (kuva 4). Lisäksi nämä tiedot osoittavat, että kaikki DELLA-geenit ilmentyvät SAM-soluissa ja että niiden ilmentyminen ulottuu kollektiivisesti koko SAM-soluihin.
Seuraavaksi analysoimme solunjakautumisparametreja villityypin SAM:ssa (Ler, kontrolli) ja gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della-viidennellä nukleotidilla (globaali) varustetussa solussa (kuva 6a, b). Mielenkiintoista kyllä, havaitsimme tilastollisesti merkitsevän muutoksen solunjakautumiskulmien frekvenssien jakaumassa della-globaalissa mutantti-SAM:ssa verrattuna villityyppiin (kuva 6c). Tämä muutos della-globaalissa mutantissa johtui 80–90° kulmien (34,71 % vs. 24,55 %) ja vähäisemmässä määrin 70–80° kulmien (23,78 % vs. 20,18 %) taajuuden kasvusta, eli ne vastaavat poikittaisia solunjakaumia (kuva 6c). Myös ei-poikittaisten jakautumisten (0–60°) esiintymistiheys oli pienempi della-globaalissa mutantissa (kuva 6c). Poikittaisten solunjakautumisten esiintymistiheys oli merkittävästi lisääntynyt della-globaalin mutantin SAM:ssa (kuva 6b). Myös poikittaisten solujakautumisten esiintymistiheys IPR:ssä oli korkeampi della global -mutantilla verrattuna villityyppiin (kuva 6d). IPR-alueen ulkopuolella villityypillä oli tasaisempi solujakautumiskulmien jakauma, kun taas della global -mutantti suosi tangentiaalisia jakautumisia kuten IPR (kuva 6e). Määritimme myös solujakautumisten suunnan ga2-oksidaasin (ga2ox) viisisolumutanttien (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ja ga2ox6-2) SAM:ssa. Kyseessä on GA-inaktiivinen mutanttitausta, johon GA kertyy. Yhdenmukaisesti GA-tasojen nousun kanssa viisikko-ga2ox-mutanttikukinnon SAM oli suurempi kuin Col-0:n (lisäkuva 12a, b), ja Col-0:aan verrattuna viisikko-ga2ox-SAM osoitti selvästi erilaisen solujen jakautumiskulmien jakauman, kulmataajuuden noustessa 50°:sta 90°:een, eli jälleen suosien tangentiaalisia jakautumisia (lisäkuva 12a–c). Täten osoitamme, että GA-signaloinnin konstitutiivinen aktivointi ja GA:n kertyminen indusoivat lateraalisia solujen jakautumisia IPR:ssä ja muualla SAM:ssa.
a, b PI-värjätyn Ler (a) -solun ja globaalin della-mutantin (b) SAM-solun L1-kerroksen 3D-visualisointi konfokaalimikroskopialla. SAM-soluihin (mutta ei alkusoluun) 10 tunnin aikana muodostuneet uudet soluseinät on esitetty ja väritetty niiden kulma-arvojen mukaan. Pieni kuva näyttää SAM-solun 0 tunnin kohdalla. Väripalkki näkyy oikeassa alakulmassa. Nuoli kohdassa (b) osoittaa esimerkkiin linjatuista solutiedostoista globaalissa della-mutantissa. Koe toistettiin kahdesti samankaltaisin tuloksin. e solujen jakautumistasojen orientaatioiden frekvenssijakauman vertailu koko SAM-solussa (d), IPR-solussa (e) ja ei-IPR-solussa (f) Lerin ja globaalin dellan välillä. P-arvot saatiin käyttämällä kaksisuuntaista Kolmogorov-Smirnov-testiä. f, g PI-värjätyn Col-0 (i) - ja pCUC2::gai-1-VENUS (j) -transgeenisten kasvien SAM-solun konfokaalikuvien 3D-visualisointi. Paneelit (a, b) näyttävät SAM:iin 10 tunnin sisällä muodostuneita uusia soluseiniä (mutta ei alkusoluja). Koe toistettiin kahdesti, ja tulokset olivat samankaltaisia. h–j Koko SAM:ssa (h), IPR:ssä (i) ja ei-IPR:ssä (j) sijaitsevien solujen jakautumistaso-orientaatioiden frekvenssijakauman vertailu Col-0- ja pCUC2::gai-1-VENUS-kasvien välillä. P-arvot saatiin käyttämällä kaksisuuntaista Kolmogorov–Smirnov-testiä.
Seuraavaksi testasimme GA-signaloinnin eston vaikutusta spesifisesti IPR:ssä. Tätä varten käytimme sirkkalehden cup 2 (CUC2) -promoottoria ohjaamaan dominantin negatiivisen gai-1-proteiinin ilmentymistä fuusioituna VENUS-soluihin (pCUC2::gai-1-VENUS-solulinjassa). Villityypin SAM:ssa CUC2-promoottori ohjaa useimpien IPR:ien ilmentymistä SAM:ssa, mukaan lukien reunasolut, P4:stä eteenpäin, ja samanlaista spesifistä ilmentymistä havaittiin pCUC2::gai-1-VENUS-kasveissa (katso alla). Solunjakautumiskulmien jakauma pCUC2::gai-1-VENUS-kasvien SAM:ssa tai IPR:ssä ei eronnut merkittävästi villityypin vastaavasta, vaikka yllättäen havaitsimme, että solut, joilla ei ollut IPR:ää näissä kasveissa, jakautuivat korkeammalla taajuudella, 80–90° (kuva 6f–j).
On ehdotettu, että solunjakautumisen suunta riippuu SAM:n geometriasta, erityisesti kudoskaarevuuden aiheuttamasta vetojännityksestä46. Siksi kysyimme, muuttuiko SAM:n muoto della global -mutantissa ja pCUC2::gai-1-VENUS-kasveissa. Kuten aiemmin on raportoitu12, della global -mutantti-SAM:n koko oli suurempi kuin villityypin (lisäkuva 13a, b, d). CLV3:n ja STM-RNA:n in situ -hybridisaatio vahvisti meristeemin laajenemisen della-mutanteissa ja osoitti edelleen kantasolulokeron lateraalisen laajenemisen (lisäkuva 13e, f, h, i). SAM:n kaarevuus oli kuitenkin samanlainen molemmissa genotyypeissä (lisäkuva 13k, m, n, p). Havaitsimme samanlaisen koon kasvun gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della -nelinkertaisessa mutantissa ilman kaarevuuden muutosta villityyppiin verrattuna (lisäkuva 13c, d, g, j, l, o, p). Myös solunjakautumisen suuntautumisen tiheys vaikutti della-nelinkertaisessa mutantissa, mutta vähäisemmässä määrin kuin della-monoliittisessa mutantissa (lisäkuva 12d–f). Tämä annosvaikutus yhdessä kaarevuuden puuttumisen kanssa viittaa siihen, että Della-nelinkertaisen mutantin jäännös-RGL3-aktiivisuus rajoittaa DELLA-aktiivisuuden menetyksen aiheuttamia muutoksia solunjakautumisen suuntautumisessa ja että muutokset lateraalisissa solunjakautumisissa tapahtuvat vasteena GA-signalointiaktiivisuuden muutoksiin pikemminkin kuin SAM-geometrian muutoksiin. Kuten edellä on kuvattu, CUC2-promoottori ohjaa IPR:n ilmentymistä SAM:ssa alkaen P4:stä (lisäkuva 14a, b), ja sitä vastoin pCUC2::gai-1-VENUS SAM:lla oli pienempi koko, mutta suurempi kaarevuus (lisäkuva 14c–h). Tämä muutos pCUC2::gai-1-VENUS SAM -morfologiassa voi johtaa mekaanisten jännitysten erilaiseen jakautumiseen verrattuna villityyppiin, jossa suuret kehäjännitysten alkavat lyhyemmältä etäisyydeltä SAM-keskuksesta47. Vaihtoehtoisesti pCUC2::gai-1-VENUS SAM -morfologian muutokset voivat johtua transgeenien ilmentymisen aiheuttamista alueellisten mekaanisten ominaisuuksien muutoksista48. Molemmissa tapauksissa tämä voisi osittain kompensoida GA-signaloinnin muutosten vaikutuksia lisäämällä todennäköisyyttä, että solut jakautuvat kehämäisessä/poikittaisessa suunnassa, mikä selittää havaintomme.
Yhteenvetona voidaan todeta, että datamme vahvistavat, että voimakkaammalla GA-signaloinnilla on aktiivinen rooli solunjakautumistasossa IPR:ssä. Ne osoittavat myös, että meristeemin kaarevuus vaikuttaa myös solunjakautumistasoon IPR:ssä.
IPR:n jakautumistasojen poikittainen suuntaus, joka johtuu korkeasta GA-signalointiaktiivisuudesta, viittaa siihen, että GA esijärjestää säteittäisen solutiedoston epidermiksessä SAM:n sisällä määrittääkseen soluorganisaation, joka myöhemmin löytyy epidermiksen internodista. Tällaiset solutiedostot olivatkin usein näkyvissä della global -mutanttien SAM-kuvissa (kuva 6b). Näin ollen, tutkiaksemme tarkemmin GA-signaloinnin spatiaalisen kuvion kehitysfunktiota SAM:ssa, käytimme aikaviivekuvausta analysoidaksemme solujen spatiaalista organisaatiota IPR:ssä villityypin (Ler ja Col-0), della global -mutanttien ja pCUC2::gai-1-VENUS-transgeenisten kasvien IPR:ssä.
Havaitsimme, että qmRGA osoitti GA-signalointiaktiivisuuden IPR:ssä lisääntyvän P1/P2:sta ja saavuttavan huippunsa P4:ssä, ja tämä kuvio pysyi vakiona ajan kuluessa (kuva 4a–f ja lisäkuva 8c–f, k). Analysoidaksemme solujen spatiaalista organisaatiota IPR:ssä lisääntyvän GA-signaalin myötä, merkitsimme Ler IPR -solut P4:n ylä- ja sivuille niiden kehityskohtalon mukaan, joka analysoitiin 34 tuntia ensimmäisen havainnon jälkeen eli yli kaksi plastidikertaa. Tämä mahdollisti meille IPR-solujen seuraamisen alkusolukehityksen aikana P1/P2:sta P4:ään. Käytimme kolmea eri väriä: keltaista niille soluille, jotka olivat integroituneet alkusoluun lähellä P4:ää, vihreää niille, jotka olivat IPR:ssä, ja violettia niille, jotka osallistuivat molempiin prosesseihin (kuva 7a–c). Hetkellä t0 (0 h) P4:n edessä oli näkyvissä 1–2 kerrosta IPR-soluja (kuva 7a). Kuten odotettua, kun nämä solut jakautuivat, ne tekivät sen pääasiassa poikittaisen jakautumistasojen kautta (kuvat 7a–c). Samankaltaisia tuloksia saatiin käyttämällä Col-0 SAM:ia (keskittyen P3:een, jonka reuna taittuu samalla tavalla kuin P4 Ler:ssä), vaikka tässä genotyypissä kukkareunaan muodostunut taitos piilotti IPR-solut nopeammin (kuva 7g–i). Siten IPR-solujen jakautumismalli ennalta järjestää solut säteittäisiin riveihin, kuten internodeissa. Säteittäisten rivien organisoituminen ja IPR-solujen lokalisoituminen peräkkäisten elinten välillä viittaavat siihen, että nämä solut ovat internodaalisia progenitoreita.
Kehitimme tässä työssä ratiometrisen GA-signalointibiosensorin, qmRGA:n, joka mahdollistaa yhdistetyistä GA- ja GA-reseptoripitoisuuksista johtuvan GA-signalointiaktiivisuuden kvantitatiivisen kartoituksen samalla minimoiden häiriöt endogeenisten signalointireittien kanssa, tarjoten siten tietoa GA:n toiminnasta solutasolla. Tätä varten rakensimme modifioidun DELLA-proteiinin, mRGA:n, joka on menettänyt kyvyn sitoutua DELLA-vuorovaikutuskumppaneihin, mutta on edelleen herkkä GA:n indusoimalle proteolyysille. qmRGA reagoi sekä eksogeenisiin että endogeenisiin GA-tasojen muutoksiin, ja sen dynaamiset aistiominaisuudet mahdollistavat GA-signalointiaktiivisuuden spatiotemporaalisten muutosten arvioinnin kehityksen aikana. qmRGA on myös erittäin joustava työkalu, koska sitä voidaan mukauttaa eri kudoksiin muuttamalla sen ilmentämiseen käytettyä promoottoria (tarvittaessa). Ottaen huomioon GA-signalointireitin ja PFYRE-motiivin konservoituneen luonteen koppisiemenisissä, se on todennäköisesti siirrettävissä muihin lajeihin22. Tämän mukaisesti riisin SLR1 DELLA -proteiinin vastaavan mutaation (HYY497AAA) osoitettiin myös estävän SLR1:n kasvua repressorinaktiivisuutta samalla kun se vain hieman vähensi sen GA-välitteistä hajoamista, samalla tavalla kuin mRGA23:ssa. Erityisesti Arabidopsis-kasvilla tehdyt viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että yksi aminohappomutaatio PFYRE-domeenissa (S474L) muutti RGA:n transkriptionaalista aktiivisuutta vaikuttamatta sen kykyyn olla vuorovaikutuksessa transkriptiotekijäkumppaneiden kanssa50. Vaikka tämä mutaatio on hyvin lähellä mRGA:ssa esiintyviä kolmea aminohapposubstituutiota, tutkimuksemme osoittavat, että nämä kaksi mutaatiota muuttavat DELLA:n erillisiä ominaisuuksia. Vaikka useimmat transkriptiotekijäkumppanit sitoutuvat DELLA26,51:n LHR1- ja SAW-domeeneihin, jotkut PFYRE-domeenin konservoituneet aminohapot voivat auttaa vakauttamaan näitä vuorovaikutuksia.
Solmuvälien kehitys on keskeinen ominaisuus kasvien arkkitehtuurissa ja sadon parantumisessa. qmRGA paljasti korkeamman GA-signalointiaktiivisuuden IPR-solmuvälien kantasoluissa. Yhdistämällä kvantitatiivisen kuvantamisen ja genetiikan osoitimme, että GA-signalointikuviot asettuvat päällekkäin pyöreiden/poikittaisten solunjakautumistasojen kanssa SAM-epidermissä, muokkaaen solunjakautumisen organisaatiota, jota tarvitaan solunjakautumisen kehitykseen. Kehityksen aikana on tunnistettu useita solunjakautumistasoa sääteleviä aineita52,53. Työmme tarjoaa selkeän esimerkin siitä, miten GA-signalointiaktiivisuus säätelee tätä soluparametria. DELLA voi olla vuorovaikutuksessa esilaskostuvien proteiinikompleksien kanssa41, joten GA-signalointi voi säädellä solunjakautumistasoa vaikuttamalla suoraan aivokuoren mikrotubulusten orientaatioon40,41,54,55. Osoitimme yllättäen, että SAM:ssa korkeamman GA-signalointiaktiivisuuden korrelaatti ei ollut solujen pidentyminen tai jakautuminen, vaan ainoastaan kasvuanisotropia, mikä on yhdenmukaista GA:n suoran vaikutuksen kanssa solunjakautumisen suuntaan IPR:ssä. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että tämä vaikutus voisi olla myös epäsuora, esimerkiksi GA:n indusoiman soluseinän pehmenemisen välittämä56. Soluseinän ominaisuuksien muutokset aiheuttavat mekaanista rasitusta57,58, joka voi myös vaikuttaa solunjakautumistason orientaatioon vaikuttamalla kortikaalisten mikrotubulusten orientaatioon39,46,59. GA:n aiheuttaman mekaanisen rasituksen ja GA:n suoran mikrotubulusten orientaation säätelyn yhteisvaikutukset voivat olla mukana muodostamassa tietyn solunjakautumisen orientaatiomallin IPR:ssä internodien määrittelemiseksi, ja tämän ajatuksen testaamiseksi tarvitaan lisätutkimuksia. Samoin aiemmat tutkimukset ovat korostaneet DELLA:n kanssa vuorovaikutuksessa olevien proteiinien TCP14 ja 15 merkitystä internodien muodostumisen säätelyssä60,61, ja nämä tekijät voivat välittää GA:n vaikutusta yhdessä BREVIPEDICELLUS (BP) ja PENNYWISE (PNY) -bakteerien kanssa, jotka säätelevät internodien kehitystä ja joiden on osoitettu vaikuttavan GA-signalointiin2,62. Koska DELLA:t ovat vuorovaikutuksessa brassinosteroidi-, etyleeni-, jasmonihapo- ja abskissihappo (ABA) -signalointireittien kanssa63,64 ja että nämä hormonit voivat vaikuttaa mikrotubulusten orientaatioon65, GA:n vaikutukset solunjakautumisorientaatioon voivat välittyä myös muiden hormonien kautta.
Varhaiset sytologiset tutkimukset osoittivat, että sekä Arabidopsis-sienen soluvälikerroksen (SAM) sisä- että ulkoalueita tarvitaan internodien kehitykseen2,42. Se, että GA säätelee aktiivisesti solujen jakautumista sisäkudoksissa12, tukee GA:n kaksoistehtävää meristeemin ja internodien koon säätelyssä SAM:ssa. Suunnatun solujakautumisen mallia säädellään myös tiukasti sisemmässä SAM-kudoksessa, ja tämä säätely on välttämätöntä varren kasvulle52. On mielenkiintoista tutkia, onko GA:lla myös roolia solunjakautumistason suuntaamisessa sisäisessä SAM-organisaatiossa, synkronoiden siten internodien määrittelyä ja kehitystä SAM:ssa.
Kasveja kasvatettiin in vitro maaperässä tai 1 % sakkaroosilla ja 1 % agarilla (Sigma) täydennettyssä 1x Murashige-Skoog (MS) -elatusaineessa (Duchefa) standardiolosuhteissa (16 h valoa, 22 °C), lukuun ottamatta hypokotyyli- ja juurikasvukokeita, joissa taimia kasvatettiin pystysuorilla maljoilla jatkuvassa valossa ja 22 °C:ssa. Nitraattikokeita varten kasveja kasvatettiin modifioidulla MS-elatusaineella (bioWORLD-kasvielatusaine), johon oli lisätty riittävästi nitraattia (0 tai 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukkinaattia, 1 % sakkaroosia ja 1 % A-agaria (Sigma), pitkän päivän olosuhteissa.
pDONR221:een insertoitu GID1a-cDNA rekombinoitiin pDONR P4-P1R-pUBQ10:n ja pDONR P2R-P3-mCherryn kanssa pB7m34GW:hen, jolloin muodostui pUBQ10::GID1a-mCherry. pDONR221:een insertoitu IDD2-DNA rekombinoitiin pB7RWG266:een, jolloin muodostui p35S:IDD2-RFP. pGID1b::2xmTQ2-GID1b:n luomiseksi monistettiin ensin 3,9 kb:n fragmentti GID1b:n koodaavan alueen ylävirtaan ja 4,7 kb:n fragmentti, joka sisälsi GID1b-cDNA:n (1,3 kb) ja terminaattorin (3,4 kb), käyttämällä lisätaulukon 3 alukkeita ja sitten insertoitiin pDONR P4-P1R:ään (Thermo Fisher Scientific) ja pDONR P2R-P3:een (Thermo Fisher Scientific) ja lopuksi rekombinoitiin pDONR221 2xmTQ268:n kanssa pGreen 012567 -kohdevektoriin käyttäen Gateway-kloonausta. pCUC2::LSSmOrange-plasmidin luomiseksi CUC2-promoottorisekvenssi (3229 bp ATG:stä ylävirtaan) ja sitä seuraava suuren Stokes-siirtymän omaavan mOrange (LSSmOrange)69:n koodaava sekvenssi N7-ytimen lokalisaatiosignaalin ja NOS-transkriptionaalisen terminaattorin kera koottiin pGreen-kanamysiinikohdistusvektoriksi käyttäen Gateway 3-fragmenttirekombinaatiojärjestelmää (Invitrogen). Kasvibinäärivektori vietiin Agrobacterium tumefaciens -kantaan GV3101 ja vietiin Nicotiana benthamiana -lehtiin Agrobacterium-infiltraatiomenetelmällä ja Arabidopsis thaliana Col-0:aan kukkadippausmenetelmällä. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry ja pCLV3::mCherry-NLS qmRGA eristettiin vastaavasti risteytysten F3- ja F1-jälkeläisistä.
RNA:n in situ -hybridisaatio suoritettiin noin 1 cm pitkille versonkärjille72, jotka kerättiin ja fiksoitiin välittömästi 4 °C:seen esijäähdytettyyn FAA-liuokseen (3,7 % formaldehydiä, 5 % etikkahappoa, 50 % etanolia). Kahden 15 minuutin tyhjiökäsittelyn jälkeen fiksatiivi vaihdettiin ja näytteitä inkuboitiin yön yli. GID1a-, GID1b-, GID1c-, GAI-, RGL1-, RGL2- ja RGL3-cDNA:t ja niiden 3'-UTR:ien antisense-koettimet syntetisoitiin käyttämällä lisätaulukossa 3 esitettyjä alukkeita Rosierin ym.73 kuvaamalla tavalla. Digoksigeniinileimatut koettimet immunodetektoitiin käyttämällä digoksigeniinivasta-aineita (3000-kertainen laimennus; Roche, luettelonumero: 11 093 274 910), ja leikkeet värjättiin 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti (BCIP, 250-kertainen laimennus) / nitrosininen tetratsolium (NBT, 200-kertainen laimennus) -liuoksella.
Julkaisun aika: 10. helmikuuta 2025