Varren apikaalimeristeemin (SAM) kasvu on kriittistä varren arkkitehtuurille. Kasvihormonitgibberelliinit(GA:illa) on keskeinen rooli kasvien kasvun koordinoinnissa, mutta niiden roolia SAM:ssa ymmärretään edelleen huonosti. Täällä kehitimme GA-signaloinnin ratiometrisen biosensorin muokkaamalla DELLA-proteiinia estämään sen olennainen säätelytoiminto GA-transkriptiovasteessa säilyttäen samalla sen hajoamisen GA-tunnistuksen yhteydessä. Osoitamme, että tämä hajoamiseen perustuva biosensori tallentaa tarkasti muutokset GA-tasoissa ja solutunnistuksessa kehityksen aikana. Käytimme tätä biosensoria kartoittamaan GA-signalointiaktiivisuutta SAM:ssa. Osoitamme, että korkeat GA-signaalit ovat läsnä pääasiassa soluissa, jotka sijaitsevat elimen primordioiden välissä, jotka ovat solmuvälisten solujen esiasteita. Toiminnan vahvistumisen ja häviämisen lähestymistapoja käyttämällä osoitamme edelleen, että GA säätelee solunjakotason suuntausta ja muodostaa solmuvälien kanonisen soluorganisaation, mikä edistää solmujen välistä spesifikaatiota SAM:ssa.
Verkon kärjessä sijaitseva verson apikaalinen meristeemi (SAM) sisältää niche-kantasoluja, joiden toiminta synnyttää sivuelimiä ja kantasolmuja modulaarisesti ja iteratiivisesti koko kasvin elinkaaren ajan. Jokainen näistä toistuvista yksiköistä tai kasvisolmuista sisältää solmujen väliset ja lateraaliset elimet sekä lehtien kainaloissa olevat kainaloiden meristeemit1. Kasvin solmujen kasvu ja organisointi muuttuvat kehityksen aikana. Arabidopsiksessa nivelten välinen kasvu estyy vegetatiivisen vaiheen aikana, ja kainalomeristeemit pysyvät lepotilassa ruusukkeen lehtien kainaloissa. Siirtyessään kukkavaiheeseen SAM:sta tulee kukinnan meristeemi, joka synnyttää pitkänomaisia nivelten välisiä ja kainalosilmuja, oksalehtiä kukkalehtien kainaloihin ja myöhemmin lehdettömiä kukkia2. Vaikka olemme edistyneet merkittävästi lehtien, kukkien ja oksien alkamista ohjaavien mekanismien ymmärtämisessä, solmuvälien syntymisestä tiedetään suhteellisen vähän.
GA:iden spatiotemporaalisen jakautumisen ymmärtäminen auttaa ymmärtämään paremmin näiden hormonien toimintoja eri kudoksissa ja eri kehitysvaiheissa. Visualisointi RGA-GFP-fuusion hajoamisesta, joka ilmaistaan sen oman promoottorin vaikutuksesta, tarjoaa tärkeää tietoa GA:n kokonaistasojen säätelystä juurissa15,16. RGA-ilmentyminen vaihtelee kuitenkin kudoksissa17 ja GA18 säätelee sitä. Siten RGA-promoottorin erilainen ilmentyminen voi johtaa RGA-GFP:llä havaittuun fluoresenssikuvioon, eikä tämä menetelmä ole näin ollen kvantitatiivinen. Äskettäin bioaktiivinen fluoreseiini (Fl) -leimattu GA19,20 paljasti GA:n kertymisen juuren endokorteksissa ja sen solutasojen säätelyn GA-kuljetuksen avulla. Äskettäin GA FRET -anturi nlsGPS1 osoitti, että GA-tasot korreloivat solujen pidentymisen kanssa juurissa, filamenteissa ja tummissa varsissa21. Kuten olemme nähneet, GA-pitoisuus ei kuitenkaan ole ainoa GA-signalointiaktiivisuutta ohjaava parametri, koska se riippuu monimutkaisista tunnistusprosesseista. Tässä DELLA- ja GA-signalointireittejä koskevan ymmärryksemme pohjalta raportoimme hajoamiseen perustuvan ratiometrisen biosensorin kehittämisestä ja karakterisoinnista GA-signalointiin. Tämän kvantitatiivisen biosensorin kehittämiseksi käytimme mutanttia GA-herkkää RGA:ta, joka oli fuusioitu fluoresoivaan proteiiniin ja joka ilmentyi kaikkialla kudoksissa, sekä GA-herkkää fluoresoivaa proteiinia. Osoitamme, että mutantti-RGA-proteiinifuusiot eivät häiritse endogeenistä GA-signalointia, kun niitä ekspressoidaan kaikkialla, ja että tämä biosensori voi kvantifioida signalointiaktiivisuuden, joka johtuu sekä GA-syötteen että GA-signaalin käsittelystä anturilaitteella korkealla spatiotemporaalisella resoluutiolla. Käytimme tätä biosensoria kartoittaaksemme GA-signalointiaktiivisuuden spatiotemporaalista jakaumaa ja kvantifioidaksemme, kuinka GA säätelee solujen käyttäytymistä SAM-orderiksessa. Osoitamme, että GA säätelee SAM-solujen jakautumistasoa, joka sijaitsee elinten primordioiden välissä, ja määrittelee siten solmuvälin kanonisen soluorganisaation.
Lopuksi kysyimme, voisiko qmRGA raportoida muutoksista endogeenisissa GA-tasoissa käyttämällä kasvavia hypovarsia. Osoitimme aiemmin, että nitraatti stimuloi kasvua lisäämällä GA-synteesiä ja puolestaan DELLA34:n hajoamista. Näin ollen havaitsimme, että hypocotyl pituus pUBQ10:: qmRGA taimia kasvatettu runsaasti nitraattia tarjontaa (10 mM NO3-) oli merkittävästi pidempi kuin taimet kasvatettu nitraatti-puutos olosuhteissa (täydentävä kuva 6a). Kasvuvasteen mukaisesti GA-signaalit olivat korkeampia 10 mM NO3-olosuhteissa kasvatettujen taimien hypovarsissa kuin ilman nitraattia kasvatetuissa taimissa (täydentävä kuva 6b, c). Siten qmRGA mahdollistaa myös endogeenisten GA-pitoisuuden muutosten aiheuttamien GA-signaloinnin muutosten seurannan.
Ymmärtääksemme, riippuuko qmRGA:n havaitsema GA-signalointiaktiivisuus GA-pitoisuudesta ja GA-havainnosta, kuten anturin suunnittelun perusteella odotettiin, analysoimme kolmen GID1-reseptorin ilmentymistä vegetatiivisissa ja lisääntymiskudoksissa. Taimissa GID1-GUS-reportterilinja osoitti, että GID1a ja c ilmentyivät voimakkaasti sirkkalehtissä (kuvat 3a-c). Lisäksi kaikki kolme reseptoria ekspressoituivat lehdissä, sivujuuren alkuaineissa, juurenkärissä (paitsi GID1b:n juurikorkkia) ja verisuonijärjestelmässä (kuvat 3a-c). Kukintojen SAM:ssa havaitsimme GUS-signaaleja vain GID1b:lle ja 1c:lle (täydentävä kuva 7a-c). In situ -hybridisaatio vahvisti nämä ilmentymismallit ja osoitti edelleen, että GID1c ilmeni tasaisesti alhaisilla tasoilla SAM:ssa, kun taas GID1b osoitti korkeampaa ilmentymistä SAM:n reuna-alueilla (täydentävä kuva 7d-l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b-translaatiofuusio paljasti myös GID1b:n ilmentymisen asteittaisen vaihteluvälin alhaisesta tai ei-ei ilmentymisestä SAM:n keskustassa korkeaan ilmentymiseen elinten rajoilla (täydentävä kuva 7m). Siten GID1-reseptorit eivät ole jakautuneet tasaisesti kudoksiin ja niiden sisällä. Myöhemmissä kokeissa havaitsimme myös, että GID1:n (pUBQ10::GID1a-mCherry) yli-ilmentyminen lisäsi hypovarsien qmRGA:n herkkyyttä ulkoiselle GA-sovellukselle (kuvio 3d, e). Sitä vastoin hypovarren qd17mRGA:lla mitattu fluoresenssi oli epäherkkä GA3-käsittelylle (kuvio 3f, g). Molemmissa määrityksissä taimia käsiteltiin korkeilla GA-pitoisuuksilla (100 µM GA3) anturin nopean käyttäytymisen arvioimiseksi, jolloin kyky sitoutua GID1-reseptoriin parani tai hävisi. Yhdessä nämä tulokset vahvistavat, että qmRGA-biosensori toimii yhdistettynä toimintona GA- ja GA-sensorina, ja viittaavat siihen, että GID1-reseptorin differentiaalinen ilmentyminen voi merkittävästi moduloida anturin emissiokykyä.
Toistaiseksi GA-signaalien jakautuminen SAM:ssa on edelleen epäselvä. Siksi käytimme qmRGA:ta ilmentäviä kasveja ja pCLV3::mCherry-NLS-kantasolureportteria35 laskeaksemme korkearesoluutioisia kvantitatiivisia GA-signalointiaktiivisuuden karttoja keskittyen L1-kerrokseen (epidermis; kuva 4a, b, katso Menetelmät ja lisämenetelmät), koska L3:lla on avainrooli SAM:n kasvun hallinnassa. Tässä pCLV3::mCherry-NLS-ilmentyminen tarjosi kiinteän geometrisen vertailupisteen GA-signalointiaktiivisuuden spatiotemporaalisen jakauman analysointiin37. Vaikka GA:ta pidetään välttämättömänä sivuelinten kehitykselle4, havaitsimme, että GA-signaalit olivat alhaiset kukka-primordiumissa (P) P3-vaiheesta alkaen (kuvat 4a, b), kun taas nuorilla P1- ja P2-primordiumilla oli kohtalainen aktiivisuus, joka oli samanlainen kuin keskialueella (kuva 4a, b). Korkeampi GA-signalointiaktiivisuus havaittiin elimen primordiumin rajoilla alkaen P1/P2:sta (rajan sivuilta) ja saavuttaen huippunsa P4:ssä, sekä kaikissa primordiumin välissä sijaitsevien perifeerisen alueen soluissa (kuvat 4a, b ja täydentävät kuviot 8a, b). Tämä korkeampi GA-signalointiaktiivisuus havaittiin paitsi orvaskedessä myös L2- ja ylemmissä L3-kerroksissa (täydentävä kuva 8b). Malli GA-signaaleja havaittu SAM käyttämällä qmRGA pysyi muuttumattomana ajan mittaan (lisäkuvat 8c-f, k). Vaikka qd17mRGA-rakennetta säädettiin systemaattisesti alas T3-kasvien SAM:ssa viidestä itsenäisestä linjasta, jotka karakterisoimme yksityiskohtaisesti, pystyimme analysoimaan pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstruktilla saatuja fluoresenssikuvioita (täydentävä kuva 8g-j, l). Tässä kontrollilinjassa vain vähäisiä muutoksia fluoresenssisuhteessa havaittiin SAM:ssa, mutta SAM-keskuksessa havaitsimme selkeän ja odottamattoman TagBFP:hen liittyvän VENUS:n vähenemisen. Tämä vahvistaa, että qmRGA:n havaitsema signalointikuvio heijastaa mRGA-VENUS:n GA-riippuvaista hajoamista, mutta osoittaa myös, että qmRGA voi yliarvioida GA-signalointiaktiivisuuden meristeemikeskuksessa. Yhteenvetona, tuloksemme paljastavat GA-signalointikuvion, joka heijastaa ensisijaisesti primordioiden jakautumista. Tämä alkuaikojen välisen alueen (IPR) jakauma johtuu korkean GA-signalointiaktiivisuuden asteittaisesta muodostumisesta kehittyvän primordiumin ja keskusalueen välille, samalla kun GA-signalointiaktiivisuus primordiumissa vähenee (kuvio 4c, d).
GID1b- ja GID1c-reseptorien jakautuminen (katso edellä) viittaa siihen, että GA-reseptorien erilainen ilmentyminen auttaa muokkaamaan GA-signalointiaktiivisuuden mallia SAM:ssa. Mietimme, voiko GA:n erilainen kertyminen olla mukana. Tämän mahdollisuuden tutkimiseksi käytimme nlsGPS1 GA FRET -anturia21. Lisääntynyt aktivaatiotaajuus havaittiin nlsGPS1:n SAM:ssa, jota käsiteltiin 10 µM GA4+7:llä 100 minuutin ajan (täydentävä kuva 9a–e), mikä osoittaa, että nlsGPS1 reagoi GA-pitoisuuden muutoksiin SAM:ssa, kuten juurissa21. NlsGPS1-aktivointitaajuuden tilajakauma paljasti suhteellisen alhaiset GA-tasot SAM:n ulkokerroksissa, mutta osoitti, että ne olivat koholla SAM:n keskellä ja rajoilla (kuva 4e ja täydentävä kuva 9a, c). Tämä viittaa siihen, että GA on myös jakautunut SAM:ssa spatiaalisella kuviolla, joka on verrattavissa qmRGA:n paljastamaan. Täydentävänä lähestymistavana käsittelimme SAM:ää myös fluoresoivalla GA:lla (GA3-, GA4-, GA7-Fl) tai Fl:llä pelkästään negatiivisena kontrollina. Fl-signaali jakautui koko SAM:iin, mukaan lukien keskusalue ja alkukanta, vaikkakin alhaisemmalla intensiteetillä (kuva 4j ja täydentävä kuva 10d). Sitä vastoin kaikki kolme GA-Fl:tä kertyi spesifisesti alkukantaisten rajojen sisälle ja vaihtelevassa määrin muualla IPR:ssä, GA7-Fl:n kerääntyessä IPR:n suurimpaan domeeniin (kuvio 4k ja täydentävä kuva 10a, b). Fluoresenssin intensiteetin kvantifiointi paljasti, että IPR:n ja ei-IPR:n intensiteettisuhde oli korkeampi GA-Fl-käsitellyssä SAM:ssa verrattuna Fl-käsiteltyyn SAM:iin (kuva 4l ja täydentävä kuva 10c). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että GA:ta on läsnä korkeampina pitoisuuksina IPR-soluissa, jotka sijaitsevat lähimpänä elimen rajaa. Tämä viittaa siihen, että SAM GA -signalointiaktiivisuuden malli johtuu sekä GA-reseptorien erilaisesta ilmentymisestä että GA:n erilaisesta kertymisestä IPR-soluihin lähellä elinten rajoja. Siten analyysimme paljasti GA-signaloinnin odottamattoman spatiotemporaalisen mallin, jossa aktiivisuus oli pienempi SAM:n keskustassa ja alkupäässä ja korkeampi aktiivisuus IPR:ssä reuna-alueella.
Ymmärtääksemme differentiaalisen GA-signalointiaktiivisuuden roolia SAM:ssa analysoimme GA-signalointiaktiivisuuden, solujen laajenemisen ja solunjakautumisen välistä korrelaatiota käyttämällä SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS:n reaaliaikaista aikaviivekuvausta. Ottaen huomioon GA:n roolin kasvun säätelyssä, odotettiin positiivista korrelaatiota solujen laajenemisparametrien kanssa. Siksi verrasimme ensin GA-signalointiaktiivisuuskarttoja solun pinnan kasvunopeuden karttoihin (vastaavasti solun laajenemisen voimakkuudelle tietylle solulle ja tytärsoluille jakautumisvaiheessa) ja kasvun anisotropiakarttoihin, jotka mittaavat solujen laajenemisen suuntaa (käytetään myös tässä tietylle solulle ja tytärsoluille jakautumisvaiheessa; kuva 5a, b ja lisäys). Karttamme SAM-solupinnan kasvunopeudesta ovat sopusoinnussa aikaisempien havaintojen kanssa38,39, jossa kasvunopeudet ovat minimaaliset rajalla ja maksimaaliset kasvunopeudet kehittyvissä kukissa (kuva 5a). Pääkomponenttianalyysi (PCA) osoitti, että GA-signalointiaktiivisuus korreloi negatiivisesti solupinnan kasvun intensiteetin kanssa (kuvio 5c). Osoitimme myös, että variaatioiden pääakselit, mukaan lukien GA-signalointisyöte ja kasvun intensiteetti, olivat ortogonaalisia korkean CLV3-ekspression määräämään suuntaan, mikä vahvistaa solujen poissulkemisen SAM-keskuksesta muissa analyyseissä. Spearman-korrelaatioanalyysi vahvisti PCA-tulokset (kuvio 5d), mikä osoittaa, että korkeammat GA-signaalit IPR:ssä eivät johtaneet suurempaan solun laajenemiseen. Korrelaatioanalyysi paljasti kuitenkin lievän positiivisen korrelaation GA-signalointiaktiivisuuden ja kasvun anisotropian välillä (kuvio 5c, d), mikä viittaa siihen, että korkeampi GA-signalointi IPR:ssä vaikuttaa solujen kasvun suuntaan ja mahdollisesti solunjakautumistason sijaintiin.
a, b Lämpökartat keskimääräisestä pintakasvusta (a) ja kasvun anisotropiasta (b) SAM:ssa keskiarvoina seitsemältä itsenäiseltä kasvilta (käytetään vastaavasti solun laajenemisen voimakkuuden ja suunnan vertaajina). c PCA-analyysi sisälsi seuraavat muuttujat: GA-signaali, pinnan kasvun intensiteetti, pintakasvun anisotropia ja CLV3-ekspressio. PCA-komponentti 1 korreloi pääasiassa negatiivisesti pinnan kasvun intensiteetin kanssa ja positiivisesti korreloi GA-signaalin kanssa. PCA-komponentti 2 korreloi pääasiassa positiivisesti pintakasvun anisotropian kanssa ja negatiivisesti CLV3:n ilmentymisen kanssa. Prosenttiosuudet edustavat kunkin komponentin selittämää vaihtelua. d Spearman-korrelaatioanalyysi GA-signaalin, pinnan kasvun intensiteetin ja pinnan kasvun anisotropian välillä kudosmittakaavassa CZ:ta lukuun ottamatta. Oikealla oleva numero on Spearman rho -arvo kahden muuttujan välillä. Tähdet osoittavat tapauksia, joissa korrelaatio/negatiivinen korrelaatio on erittäin merkittävä. e Col-0 SAM L1 -solujen 3D-visualisointi konfokaalimikroskopialla. SAM:iin (mutta ei primordiumiin) 10 tunnin kohdalla muodostuneet uudet soluseinät värjätään niiden kulmaarvojen mukaan. Väripalkki näkyy oikeassa alakulmassa. Upote näyttää vastaavan 3D-kuvan 0 tunnin kohdalla. Koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin. f Laatikkokaaviot näyttävät solunjakautumisnopeudet IPR:ssä ja ei-IPR Col-0 SAM:ssa (n = 10 itsenäistä kasvia). Keskiviiva näyttää mediaanin ja laatikon rajat osoittavat 25. ja 75. prosenttipisteen. Viikset osoittavat R-ohjelmistolla määritetyt minimi- ja maksimiarvot. P-arvot saatiin Welchin kaksisuuntaisella t-testillä. g, h Kaavio, joka näyttää (g) kuinka mitataan uuden soluseinän (magentan) kulma suhteessa säteittäiseen suuntaan SAM:n keskustasta (valkoinen katkoviiva) (vain teräväkulmaiset arvot eli 0–90° otetaan huomioon) ja (h) meristeemin ympärys-/sivu- ja radiaalisuunnat. i Taajuushistogrammit solujen jakautumistasosta SAM:n (tummansininen), IPR:n (keskitason sininen) ja ei-IPR:n (vaaleansininen) poikki. P-arvot saatiin kaksisuuntaisella Kolmogorov-Smirnov-testillä. Koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin. j Taajuushistogrammit IPR:n solunjakautumistason suuntauksesta P3:n (vaaleanvihreä), P4:n (keskipitkänvihreä) ja P5:n (tummanvihreä) ympärillä. P-arvot saatiin kaksisuuntaisella Kolmogorov-Smirnov-testillä. Koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin.
Siksi tutkimme seuraavaksi GA-signaloinnin ja solunjakautumisaktiivisuuden välistä korrelaatiota tunnistamalla vasta muodostuneet soluseinät määrityksen aikana (kuvio 5e). Tämä lähestymistapa antoi meille mahdollisuuden mitata solujen jakautumisen taajuutta ja suuntaa. Yllättäen havaitsimme, että solujen jakautumistiheys IPR:ssä ja muussa SAM:ssa (ei-IPR, kuva 5f) oli samanlainen, mikä osoittaa, että erot GA-signaloinnin välillä IPR- ja ei-IPR-solujen välillä eivät vaikuta merkittävästi solun jakautumiseen. Tämä ja positiivinen korrelaatio GA-signaloinnin ja kasvun anisotropian välillä sai meidät pohtimaan, voisiko GA-signalointiaktiivisuus vaikuttaa solunjakautumistason orientaatioon. Mittasimme uuden soluseinän suunnan terävänä kulmana meristeemin keskustan ja uuden soluseinän keskustan yhdistävään säteittäiseen akseliin nähden (kuva 5e-i) ja havaitsimme selvän taipumuksen solujen jakautumiseen kulmissa, jotka ovat lähellä 90° säteittäiseen akseliin nähden, korkeimmat taajuudet havaittiin välillä 70–80° ja 230,2 0,8 % (23,20–6 %). (Kuva 5e,i), joka vastaa solujakaumia kehä-/poikittaissuunnassa (kuva 5h). Tutkiaksemme GA-signaloinnin vaikutusta tähän solunjakautumiskäyttäytymiseen analysoimme solunjakoparametreja IPR:ssä ja ei-IPR:ssä erikseen (kuva 5i). Havaitsimme, että jakautumiskulmajakauma IPR-soluissa poikkesi ei-IPR-solujen tai koko SAM-solujen jakautumisesta, jolloin IPR-soluissa oli suurempi osa lateraalista/ympyrästä jakautumista eli 70-80° ja 80-90° (33,86 % ja 30,71 %, vastaavat suhteet) (kuva 1). Näin ollen havainnot paljastivat yhteyden korkean GA-signaloinnin ja solunjakautumistason suuntauksen välillä lähellä kehän suuntaa, mikä on samanlainen kuin GA-signalointiaktiivisuuden ja kasvun anisotropian välinen korrelaatio (kuvio 5c, d). Tämän assosioinnin avaruudellisen säilymisen vahvistamiseksi edelleen mittasimme jakotason orientaation primordiumia ympäröivissä IPR-soluissa alkaen P3:sta, koska korkein GA-signalointiaktiivisuus havaittiin tällä alueella alkaen P4:stä (kuvio 4). IPR:n jakautumiskulmat P3:n ja P4:n ympärillä eivät osoittaneet tilastollisesti merkitseviä eroja, vaikka lateraalisen solujakautumisen lisääntyminen havaittiin IPR:ssä P4:n ympärillä (kuvio 5j). Kuitenkin P5:n ympärillä olevissa IPR-soluissa ero solujakautumistason orientaatiossa tuli tilastollisesti merkitseväksi, jolloin poikittaisten solujakautumisten tiheys lisääntyi jyrkästi (kuvio 5j). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että GA-signalointi voi ohjata solujen jakautumisen suuntausta SAM:ssa, mikä on yhdenmukainen aiempien raporttien kanssa40,41, että korkea GA-signalointi voi indusoida solujakautumisen lateraalista orientaatiota IPR:ssä.
On ennustettu, että IPR:n soluja ei sisällytetä primordiaan vaan pikemminkin solmuväliin2, 42, 43. Solunjakaumien poikittaissuuntaus IPR:ssä voi johtaa tyypilliseen orvaskeden pituussuuntaisten rivien tyypilliseen järjestykseen solmuvälissä. Yllä kuvatut havainnot viittaavat siihen, että GA-signalointi todennäköisesti näyttelee roolia tässä prosessissa säätelemällä solun jakautumisen suuntaa.
Useiden DELLA-geenien toiminnan menetys johtaa konstitutiiviseen GA-vasteeseen, ja della-mutantteja voidaan käyttää tämän hypoteesin testaamiseen44. Analysoimme ensin viiden DELLA-geenin ilmentymismallit SAM:ssa. GUS-linjan45 transkriptiofuusio paljasti, että GAI, RGA, RGL1 ja RGL2 (paljon pienemmässä määrin) ilmentyivät SAM:ssa (täydentävä kuva 11a–d). In situ -hybridisaatio osoitti lisäksi, että GAI-mRNA kerääntyy spesifisesti primordiaan ja kehittyviin kukkoihin (täydentävä kuva 11e). RGL1- ja RGL3-mRNA havaittiin koko SAM-katoksen ja vanhemmissa kukissa, kun taas RGL2-mRNA:ta oli enemmän raja-alueella (täydentävä kuva 11f-h). pRGL3::RGL3-GFP SAM:n konfokaalinen kuvantaminen vahvisti in situ -hybridisaatiolla havaitun ilmentymisen ja osoitti, että RGL3-proteiini kerääntyy SAM:n keskiosaan (täydentävä kuva 11i). Käyttämällä pRGA::GFP-RGA-linjaa havaitsimme myös, että RGA-proteiini kerääntyy SAM:iin, mutta sen runsaus vähenee rajalla alkaen P4:stä (täydentävä kuva 11j). Erityisesti RGL3:n ja RGA:n ilmentymismallit ovat yhdenmukaisia korkeamman GA-signalointiaktiivisuuden kanssa IPR:ssä, kuten qmRGA havaitsee (kuvio 4). Lisäksi nämä tiedot osoittavat, että kaikki DELLA:t ilmaistaan SAM:ssa ja että niiden ilmaisu kattaa yhdessä koko SAM:n.
Seuraavaksi analysoimme solunjakautumisparametreja villityypin SAM:issa (Ler, kontrolli) ja gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globaali) mutanteissa (kuvio 6a, b). Mielenkiintoista on, että havaitsimme tilastollisesti merkittävän muutoksen solunjakautumiskulmataajuuksien jakautumisessa della globaalissa mutantti-SAM:ssa villityyppiin verrattuna (kuvio 6c). Tämä muutos della globaalissa mutantissa johtui 80–90° kulmien (34,71 % vs. 24,55 %) ja vähäisemmässä määrin 70–80° kulmien (23,78 % vs. 20,18 %) esiintymistiheyden lisääntymisestä, toisin sanoen, mikä vastaa solun poikittaista jakautumista (kuva 6c). Ei-poikittainen jakautumistiheys (0–60°) oli myös pienempi della global -mutantissa (kuva 6c). Poikittaissolujen jakautumistiheys lisääntyi merkittävästi della globaalin mutantin SAM:ssa (kuvio 6b). Poikittaissolujen jakautumistiheys IPR:ssä oli myös korkeampi della global -mutantissa verrattuna villityyppiin (kuvio 6d). IPR-alueen ulkopuolella villityypillä oli tasaisempi solujakautumiskulmien jakautuminen, kun taas della globaali mutantti suosi tangentiaalista jakautumista, kuten IPR (kuvio 6e). Kvantifioimme myös solujakautumisen orientaation ga2-oksidaasin (ga2ox) viisinkertaisten mutanttien (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ja ga2ox6-2) SAM:ssa, GA-inaktiivinen mutanttitausta, johon GA kerääntyy. Yhdenmukaisesti GA-tasojen nousun kanssa viisinkertaisen ga2ox-mutanttikuinnon SAM oli suurempi kuin Col-0:n (lisäkuva 12a, b), ja verrattuna Col-0:aan viisinkertainen ga2ox-SAM osoitti selvästi erilaisen solunjakautumiskulmien jakautumisen kulman taajuuden noustessa 50°:sta eli 900°:sta taas 9ingss-vision. (Lisäkuvat 12a–c). Siten osoitamme, että GA-signaloinnin ja GA:n kertymisen konstitutiivinen aktivaatio indusoivat lateraalisia solujakautumisia IPR:ssä ja muussa SAM:ssa.
a, b PI-värjätyn Ler:n (a) ja globaalin della-mutantti (b) SAM:n L1-kerroksen 3D-visualisointi konfokaalimikroskopialla. Uudet soluseinät, jotka muodostuivat SAM:iin (mutta ei primordiumiin) 10 tunnin aikana, näytetään ja värjätään niiden kulma-arvojen mukaan. Upote näyttää SAM:n kello 0. Väripalkki näkyy oikeassa alakulmassa. Nuoli kohdassa (b) osoittaa esimerkkiä kohdistetuista solutiedostoista globaalissa della-mutantissa. Koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin. ce solujakotason suuntausten taajuusjakauman vertailu koko SAM:ssa (d), IPR:ssä (e) ja ei-IPR:ssä (f) Lerin ja globaalin dellan välillä. P-arvot saatiin kaksisuuntaisella Kolmogorov-Smirnov-testillä. f, g Col-0 (i) ja pCUC2::gai-1-VENUS (j) siirtogeenisten kasvien PI-värjättyjen SAM:ien konfokaalikuvien 3D-visualisointi. Paneeleissa (a, b) näkyy uusia soluseinämiä (mutta ei primordia), jotka muodostuivat SAM:iin 10 tunnin sisällä. Koe toistettiin kahdesti samanlaisin tuloksin. h–j Koko SAM:n (h), IPR:n (i) ja ei-IPR:n (j) taajuusjakauman vertailu Col-0- ja pCUC2::gai-1-VENUS-kasvien välillä. P-arvot saatiin kaksisuuntaisella Kolmogorov-Smirnov-testillä.
Seuraavaksi testasimme GA-signaloinnin eston vaikutusta erityisesti IPR:ssä. Tätä tarkoitusta varten käytimme sirkkalehti kuppi 2 (CUC2) -promoottoria ohjaamaan hallitsevan negatiivisen gai-1-proteiinin ilmentymistä, joka on fuusioitu VENUSEEN (linjassa pCUC2::gai-1-VENUS). Villityypin SAM:ssa CUC2-promoottori ohjaa useimpien IPR:ien ilmentymistä SAM:ssa, mukaan lukien rajasolut, P4:stä eteenpäin, ja samanlainen spesifinen ilmentyminen havaittiin pCUC2::gai-1-VENUS-kasveissa (katso alla). Solunjakautumiskulmien jakautuminen pCUC2::gai-1-VENUS-kasvien SAM- tai IPR-alueella ei eronnut merkittävästi villityypin kasveista, vaikka yllättäen havaitsimme, että solut, joilla ei ollut IPR:tä, jakautuivat näissä kasveissa korkeammalla taajuudella 80–90° (kuva 6f–j).
On ehdotettu, että solun jakautumisen suunta riippuu SAM:n geometriasta, erityisesti kudoksen kaarevuuden synnyttämästä vetojännityksestä46. Siksi kysyimme, oliko SAM:n muoto muuttunut della globaalissa mutantissa ja pCUC2::gai-1-VENUS-kasveissa. Kuten aiemmin on raportoitu12, della globaalin mutantti-SAM:n koko oli suurempi kuin villityypin (lisäkuvat 13a, b, d). CLV3:n ja STM RNA:n in situ -hybridisaatio vahvisti meristeemilaajenemisen della-mutanteissa ja osoitti lisäksi kantasolujen markkinaraon lateraalista laajenemista (täydentävä kuva 13e, f, h, i). SAM-kaarevuus oli kuitenkin samanlainen molemmissa genotyypeissä (lisäkuva 13k, m, n, p). Havaitsimme samanlaisen koon kasvun gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della nelinkertaisessa mutantissa ilman kaarevuuden muutosta villityyppiin verrattuna (lisäkuva 13c, d, g, j, l, o, p). Solunjakautumisen taajuus vaikutti myös della-neljäsmutantissa, mutta vähemmän kuin della monoliittisessa mutantissa (täydentävä kuva 12d-f). Tämä annostusvaikutus yhdessä kaarevuuden vaikutuksen puutteen kanssa viittaa siihen, että Della-neljäsmutantin RGL3-jäännösaktiivisuus rajoittaa DELLA-aktiivisuuden häviämisen aiheuttamia muutoksia solunjakautumisen orientaatiossa ja että muutokset lateraalisissa solujakaumissa tapahtuvat vasteena GA-signalointiaktiivisuuden muutoksiin eikä SAM-geometrian muutoksiin. Kuten edellä on kuvattu, CUC2-promoottori ohjaa IPR-ilmentymistä SAM:ssa alkaen P4:stä (lisäkuvat 14a, b), ja sitä vastoin pCUC2::gai-1-VENUS SAM:lla oli pienempi koko, mutta suurempi kaarevuus (täydentävä kuva 14c-h). Tämä muutos pCUC2::gai-1-VENUS SAM -morfologiassa voi johtaa erilaiseen mekaanisten jännitysten jakautumiseen verrattuna villityyppiin, jossa suuret kehäjännitykset alkavat lyhyemmällä etäisyydellä SAM-keskuksesta47. Vaihtoehtoisesti muutokset pCUC2::gai-1-VENUS SAM -morfologiassa voivat johtua muutoksista alueellisissa mekaanisissa ominaisuuksissa, jotka siirtogeenin ilmentyminen aiheuttaa48. Molemmissa tapauksissa tämä voisi osittain kompensoida GA-signaloinnin muutosten vaikutuksia lisäämällä todennäköisyyttä, että solut jakautuvat kehä-/poikittaisessa suunnassa, mikä selittää havaintojamme.
Yhdessä tietomme vahvistavat, että korkeammalla GA-signalointilla on aktiivinen rooli solunjakotason lateraalisessa orientaatiossa IPR:ssä. Ne osoittavat myös, että meristeemin kaarevuus vaikuttaa myös solunjakautumistason orientaatioon IPR:ssä.
Jakotason poikittaissuuntaus IPR:ssä korkeasta GA-signalointiaktiivisuudesta johtuen viittaa siihen, että GA esiorganisoi säteittäisen solutiedoston orvasketeen SAM:n sisällä määrittääkseen soluorganisaation, joka myöhemmin löydetään orvaskeden välisestä solmukohdasta. Itse asiassa tällaiset solutiedostot olivat usein näkyvissä della globaalien mutanttien SAM-kuvissa (kuva 6b). Siten tutkiaksemme edelleen GA-signaloinnin spatiaalisen kuvion kehitysfunktiota SAM:ssa, käytimme aikaviivekuvausta analysoidaksemme solujen tilaorganisaatiota IPR:ssä villityypin (Ler ja Col-0), della globaaleissa mutanteissa ja pCUC2::gai-1-VENUS siirtogeenisissä kasveissa.
Huomasimme, että qmRGA osoitti, että GA-signalointiaktiivisuus IPR:ssä kasvoi P1/P2:sta ja saavutti huippunsa P4:ssä, ja tämä kuvio pysyi vakiona ajan myötä (kuvat 4a-f ja täydentävät kuvat 8c-f, k). Analysoidaksemme solujen tilaorganisaatiota IPR:ssä kasvavalla GA-signaalilla, merkitsimme Ler IPR -solut P4:n yläpuolelle ja sivuille niiden kehityskohtalonsa mukaan, joka analysoitiin 34 tuntia ensimmäisen havainnon jälkeen, eli yli kaksi plastidikertaa, jolloin voimme seurata IPR-soluja primordiumin kehityksen aikana P1/P2:sta P4:ään. Käytimme kolmea eri väriä: keltaista niille soluille, jotka integroituivat primordiumiin lähellä P4:ää, vihreää niille, jotka olivat IPR:ssä, ja violettia niille, jotka osallistuivat molempiin prosesseihin (kuvat 7a–c). Ajanhetkellä t0 (0 h) P4:n edessä oli näkyvissä 1–2 kerrosta IPR-soluja (kuva 7a). Kuten odotettiin, kun nämä solut jakautuivat, ne tekivät sen pääasiassa poikittaisjakotason kautta (kuvat 7a-c). Samanlaisia tuloksia saatiin käyttämällä Col-0 SAM:ia (keskittynyt P3:een, jonka reunapoimuttuu samalla tavalla kuin P4:ssä Lerissä), vaikka tässä genotyypissä kukkareunukselle muodostunut laskos piilotti IPR-solut nopeammin (kuvio 7g-i). Siten IPR-solujen jakautumiskuvio esiorganisoi solut säteittäisiksi riveiksi, kuten solmuvälissä. Säteittäisten rivien järjestäytyminen ja IPR-solujen lokalisointi peräkkäisten elinten välillä viittaavat siihen, että nämä solut ovat internodaalisia progenitoreita.
Täällä kehitimme ratiometrisen GA-signalointibiosensorin, qmRGA, joka mahdollistaa yhdistetyistä GA- ja GA-reseptoripitoisuuksista johtuvan GA-signalointiaktiivisuuden kvantitatiivisen kartoituksen ja minimoi samalla endogeenisten signalointireittien häiriöt ja tarjoaa siten tietoa GA-toiminnasta solutasolla. Tätä tarkoitusta varten rakensimme modifioidun DELLA-proteiinin, mRGA:n, joka on menettänyt kykynsä sitoa DELLA-vuorovaikutuskumppaneita, mutta on edelleen herkkä GA-indusoidulle proteolyysille. qmRGA reagoi sekä eksogeenisiin että endogeenisiin muutoksiin GA-tasoissa, ja sen dynaamiset tunnistusominaisuudet mahdollistavat GA-signalointiaktiivisuuden spatiotemporaalisten muutosten arvioinnin kehityksen aikana. qmRGA on myös erittäin joustava työkalu, koska se voidaan mukauttaa erilaisiin kudoksiin vaihtamalla sen ilmentämiseen käytettyä promoottoria (tarvittaessa), ja ottaen huomioon GA-signalointireitin ja PFYRE-motiivin konservoituneen luonteen koppisiementen välillä, se on todennäköisesti siirrettävissä muihin lajeihin22. Tämän mukaisesti vastaavan mutaation riisin SLR1 DELLA -proteiinissa (HYY497AAA) osoitettiin myös tukahduttavan SLR1:n kasvua estävän aktiivisuuden, samalla kun se vain pienensi sen GA-välitteistä hajoamista, samalla tavalla kuin mRGA23. Erityisesti viimeaikaiset Arabidopsis-tutkimukset osoittivat, että yksi aminohappomutaatio PFYRE-domeenissa (S474L) muutti RGA:n transkriptioaktiivisuutta vaikuttamatta sen kykyyn olla vuorovaikutuksessa transkriptiotekijäkumppanien kanssa50. Vaikka tämä mutaatio on hyvin lähellä mRGA:ssa esiintyviä kolmea aminohapposubstituutiota, tutkimuksemme osoittavat, että nämä kaksi mutaatiota muuttavat DELLAn erillisiä ominaisuuksia. Vaikka useimmat transkriptiotekijäkumppanit sitoutuvat DELLA26,51:n LHR1- ja SAW-domeeneihin, jotkin PFYRE-domeenin konservoituneet aminohapot voivat auttaa stabiloimaan näitä vuorovaikutuksia.
Solmujen välinen kehitys on keskeinen piirre kasvien arkkitehtuurissa ja sadon parantamisessa. qmRGA paljasti korkeamman GA-signalointiaktiivisuuden IPR-solmukkeiden välisissä progenitorisoluissa. Yhdistämällä kvantitatiivista kuvantamista ja genetiikkaa osoitimme, että GA-signalointikuviot asettavat päällekkäin pyöreät / poikittaissuuntaiset solunjakautumistasot SAM-orderiksessa, muovaten solujen välisen kehityksen edellyttämää solunjakautumisorganisaatiota. Kehityksen aikana on tunnistettu useita solujakautumistason säätelytekijöitä52,53. Työmme tarjoaa selkeän esimerkin siitä, kuinka GA-signalointitoiminta säätelee tätä soluparametria. DELLA voi olla vuorovaikutuksessa esilaskostuvien proteiinikompleksien kanssa41, joten GA-signalointi voi säädellä solujen jakautumistasosuuntausta vaikuttamalla suoraan aivokuoren mikrotubulusten orientaatioon40,41,54,55. Osoitimme odottamatta, että SAM:ssa korkeamman GA-signalointiaktiivisuuden korrelaatti ei ollut solujen pidentyminen tai jakautuminen, vaan vain kasvun anisotropia, mikä on yhdenmukainen GA:n suoran vaikutuksen kanssa solunjakautumisen suuntaan IPR:ssä. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä, että tämä vaikutus voisi olla myös epäsuora, esimerkiksi GA:n aiheuttaman soluseinän pehmenemisen välittämä56. Muutokset soluseinän ominaisuuksissa aiheuttavat mekaanista rasitusta57, 58, mikä voi myös vaikuttaa solun jakautumistason orientaatioon vaikuttamalla aivokuoren mikrotubulusten orientaatioon39, 46, 59. GA:n indusoiman mekaanisen rasituksen ja GA:n suoran mikrotubulusten orientaation säätelyn yhteisvaikutukset voivat olla osallisena tietyn solunjakautumisorientaatiomallin luomisessa IPR:ssä solmuvälien määrittelemiseksi, ja lisätutkimuksia tarvitaan tämän ajatuksen testaamiseksi. Samoin aikaisemmat tutkimukset ovat korostaneet DELLAn kanssa vuorovaikutteisten proteiinien TCP14 ja 15 merkitystä solmujen välisen muodostumisen hallinnassa60,61 ja nämä tekijät voivat välittää GA:n toimintaa yhdessä BREVIPEDICELLUS (BP) ja PENNYWISE (PNY) kanssa, jotka säätelevät solmujen välistä kehitystä ja joiden on osoitettu vaikuttavan GA-signalointiin2,62. Koska DELLAt ovat vuorovaikutuksessa brassinosteroidin, eteenin, jasmonihapon ja abskisiinihapon (ABA) signalointireittien kanssa63, 64 ja että nämä hormonit voivat vaikuttaa mikrotubulusten orientaatioon65, GA:n vaikutukset solunjakautumisen suuntautumiseen voivat olla myös muiden hormonien välittämiä.
Varhaiset sytologiset tutkimukset osoittivat, että sekä Arabidopsis SAM:n sisä- että ulkoalueet tarvitaan solmujen väliseen kehittymiseen2,42. Se tosiasia, että GA säätelee aktiivisesti solun jakautumista sisäkudoksissa12, tukee GA:n kaksoistoimintoa meristeemin ja solmuvälin koon säätelyssä SAM:ssa. Suuntautuvan solunjakautumisen malli on myös tiukasti säädelty sisäisessä SAM-kudoksessa, ja tämä säätely on välttämätöntä varren kasvulle52. On mielenkiintoista tutkia, onko GA:lla myös roolia solunjakotason suuntaamisessa sisäisessä SAM-organisaatiossa, jolloin synkronoidaan SAM:n sisäisten solmujen spesifikaatiot ja kehitys.
Kasveja kasvatettiin in vitro maaperässä tai 1 x Murashige-Skoog (MS) -elatusaineessa (Duchefa), jota oli täydennetty 1 % sakkaroosilla ja 1 % agarilla (Sigma) normaaleissa olosuhteissa (16 h valo, 22 °C), lukuun ottamatta hyposirkka- ja juurikasvukokeita, joissa taimia kasvatettiin pystysuoralla levyllä vakiovalossa ja 22 °C:ssa. Nitraattikokeita varten kasveja kasvatettiin modifioidulla MS-elatusaineella (bioWORLD-kasvien alusta), jota oli täydennetty riittävällä nitraatilla (0 tai 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukkinaatilla, 1 % sakkaroosilla ja 1 % A-agarilla (Sigma) pitkän päivän olosuhteissa.
pDONR221:een insertoitu GID1a-cDNA yhdistettiin uudelleen pDONR P4-P1R-pUBQ10:n ja pDONR P2R-P3-mCherryn kanssa pB7m34GW:hen pUBQ10::GID1a-mCherryn muodostamiseksi. pDONR221:een insertoitu IDD2-DNA yhdistettiin uudelleen pB7RWG266:een p35S:IDD2-RFP:n muodostamiseksi. pGID1b::2xmTQ2-GID1b:n muodostamiseksi 3,9 kb:n fragmentti ylävirtaan GID1b:tä koodaavasta alueesta ja 4,7 kb:n fragmentti, joka sisälsi GID1b:n cDNA:n (1,3 kb) ja terminaattorin (3,4 kb), monistettiin ensin käyttämällä lisätaulukon 3 alukkeita ja sitten PDONRific-insertit P1-P1R:ään. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), vastaavasti, ja lopuksi yhdistettiin uudelleen pDONR221 2xmTQ268:n kanssa kohdevektoriin pGreen 012567 käyttäen Gateway-kloonausta. pCUC2::LSSmOrangen luomiseksi CUC2-promoottorisekvenssi (3229 bp ylävirtaan ATG:stä), jota seurasi suuren Stokes-siirtyneen mOrangen (LSSmOrange)69:n koodaava sekvenssi N7-tuman lokalisointisignaalin ja NOS-transkription terminaattorin kanssa, koottiin pGreen-kanamysiinin kohdentamisjärjestelmän uudelleenkytkentävektoria3-gabinf-ragment-vektoria käyttäen. (Invitrogen). Kasvin binaarinen vektori vietiin Agrobacterium tumefaciens -kantaan GV3101 ja vietiin Nicotiana benthamianan lehtiin Agrobacterium-infiltraatiomenetelmällä ja Arabidopsis thaliana Col-0 kukkakastomenetelmällä, vastaavasti. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ja pCLV3::mCherry-NLS qmRGA eristettiin vastaavien risteytysten F3- ja F1-jälkeläisistä, vastaavasti.
RNA in situ -hybridisaatio suoritettiin noin 1 cm pituisille versonkärille72, jotka kerättiin ja kiinnitettiin välittömästi FAA-liuokseen (3,7 % formaldehydiä, 5 % etikkahappoa, 50 % etanolia), joka oli esijäähdytetty 4 °C:seen. 2 × 15 minuutin tyhjiökäsittelyn jälkeen kiinnitysaine vaihdettiin ja näytteitä inkuboitiin yön yli. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ja RGL3 cDNA:t ja antisense-koettimet niiden 3'-UTR:ille syntetisoitiin käyttämällä lisätaulukossa 3 esitettyjä alukkeita Rosier et al.73:n kuvauksen mukaisesti. Digoksigeniinileimatut koettimet immunodetekoitiin käyttämällä digoksigeniinivasta-aineita (3000-kertainen laimennos; Roche, luettelonumero: 11 093 274 910), ja leikkeet värjättiin 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatilla (BCIP)/tetranitrotsolub55-kertainen dilulium-25 (NBT, 200-kertainen laimennus) liuos.
Postitusaika: 10.2.2025