Tässä tutkimuksessa arvioitiin kaupallisten aineiden letaliteettia, subletaliteettia ja myrkyllisyyttäsypermetriiniformulaatioita nuijapäille. Akuutissa testissä testattiin 100–800 μg/l pitoisuuksia 96 tunnin ajan. Kroonisessa testissä testattiin luonnossa esiintyviä sypermetriinipitoisuuksia (1, 3, 6 ja 20 μg/l) kuolleisuuden varalta, ja sen jälkeen mikrotumatestejä ja punasolujen tumapoikkeavuuksia 7 päivän ajan. Kaupallisen sypermetriiniformulaation LC50 nuijapäille oli 273,41 μg L−1. Kroonisessa testissä korkein pitoisuus (20 μg L−1) johti yli 50 %:n kuolleisuuteen, koska se tappoi puolet testatuista nuijapäistä. Mikrotumatesti osoitti merkittäviä tuloksia 6 ja 20 μg L−1 pitoisuuksilla, ja useita tumapoikkeavuuksia havaittiin, mikä viittaa siihen, että kaupallisella sypermetriiniformulaatiolla on genotoksinen potentiaali P. gracilis -sientä vastaan. Sypermetriini on suuri riski tälle lajille, mikä osoittaa, että se voi aiheuttaa useita ongelmia ja vaikuttaa tämän ekosysteemin dynamiikkaan lyhyellä ja pitkällä aikavälillä. Siksi voidaan päätellä, että kaupallisilla sypermetriinivalmisteilla on toksisia vaikutuksia P. gracilikseen.
Maataloustoiminnan jatkuvan laajentumisen ja intensiivisen käytön vuoksituholaistorjuntaToimenpiteiden vuoksi vesieläimet altistuvat usein torjunta-aineille1,2. Vesivarojen saastuminen maatalousmaiden lähellä voi vaikuttaa muiden kuin kohde-eliöiden, kuten sammakkoeläinten, kehitykseen ja selviytymiseen.
Sammakkoeläimistä on tulossa yhä tärkeämpiä ympäristömatriisien arvioinnissa. Anuraneja pidetään hyvinä ympäristösaasteiden bioindikaattoreina niiden ainutlaatuisten ominaisuuksien, kuten monimutkaisten elinkaarien, toukkien nopean kasvunopeuden, trofian, läpäisevän ihon10,11, lisääntymisen riippuvuuden vedestä12 ja suojaamattomien munien11,13,14, vuoksi. Pieni vesisammakko (Physalaemus gracilis), joka tunnetaan yleisesti itkevänä sammakkona, on osoitettu olevan torjunta-ainesaasteiden bioindikaattorilaji4,5,6,7,15. Lajia esiintyy seisovissa vesissä, suojelualueilla tai vaihtelevien elinympäristöjen alueilla Argentiinassa, Uruguayssa, Paraguayssa ja Brasiliassa1617, ja IUCN-luokituksen mukaan sitä pidetään vakaana laajan levinneisyytensä ja erilaisten elinympäristöjen sietokykynsä vuoksi18.
Sammakkoeläimillä on raportoitu sypermetriinille altistumisen jälkeen subletaalisia vaikutuksia, mukaan lukien nuijapäiden käyttäytymiseen, morfologiaan ja biokemiallisiin muutoksiin23,24,25, kuolleisuuden ja metamorfoosiajan muutoksiin, entsymaattisiin muutoksiin, heikentyneeseen kuoriutumismenestykseen24,25, hyperaktiivisuuteen26, koliiniesteraasiaktiivisuuden estymiseen27 ja uintikyvyn muutoksiin7,28. Sypermetriinin genotoksisia vaikutuksia sammakkoeläimillä koskevat tutkimukset ovat kuitenkin rajalliset. Siksi on tärkeää arvioida epäpuhtaiden lajien herkkyyttä sypermetriinille.
Ympäristön saastuminen vaikuttaa sammakkoeläinten normaaliin kasvuun ja kehitykseen, mutta vakavin haittavaikutus on torjunta-aineille altistumisen aiheuttama DNA:n geneettinen vaurio13. Verisolujen morfologian analyysi on tärkeä bioindikaattori saastumisesta ja aineen mahdollisesta myrkyllisyydestä luonnonvaraisille lajeille29. Mikrotumatesti on yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä kemikaalien genotoksisuuden määrittämiseksi ympäristössä30. Se on nopea, tehokas ja edullinen menetelmä, joka on hyvä indikaattori eliöiden, kuten sammakkoeläinten, kemiallisesta saastumisesta31,32 ja voi antaa tietoa altistumisesta genotoksisille epäpuhtauksille33.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kaupallisten sypermetriinivalmisteiden myrkyllistä potentiaalia pienille vedessä eläville nuijapäille mikrotumatestin ja ekologisen riskinarvioinnin avulla.
P. gracilis -nuijapäiden kumulatiivinen kuolleisuus (%) testin akuutin vaiheen aikana eri pitoisuuksille kaupallista sypermetriiniä altistettuina.
Kaupallisen sypermetriinin eri pitoisuuksille kroonisen myrkyllisyystestin aikana altistettujen P. gracilis -nuijapäiden kumulatiivinen kuolleisuus (%).
Havaittu korkea kuolleisuus johtui sammakkoeläimillä havaituista genotoksisista vaikutuksista, kun ne altistuivat eri sypermetriinipitoisuuksille (6 ja 20 μg/l), mistä on osoituksena mikrotumakkeiden (MN) ja tumapoikkeavuuksien esiintyminen punasoluissa. Mikrotumakkeiden muodostuminen viittaa mitoosin virheisiin ja liittyy kromosomien heikkoon sitoutumiseen mikrotubuluksiin, kromosomien sisäänotosta ja kuljetuksesta vastaavien proteiinikompleksien virheisiin, kromosomien segregaation virheisiin ja DNA-vaurioiden korjauksen virheisiin38,39, ja se voi liittyä torjunta-aineiden aiheuttamaan oksidatiiviseen stressiin40,41. Muita poikkeavuuksia havaittiin kaikilla arvioiduilla pitoisuuksilla. Sypermetriinipitoisuuksien kasvattaminen lisäsi tumapoikkeavuuksia punasoluissa 5 % ja 20 % pienimmällä (1 μg/l) ja suurimmalla (20 μg/l) annoksella. Esimerkiksi lajin DNA:n muutoksilla voi olla vakavia seurauksia sekä lyhyen että pitkän aikavälin selviytymiselle, mikä johtaa populaation vähenemiseen, lisääntymiskyvyn muutoksiin, sisäsiittoisuuteen, geneettisen monimuotoisuuden menetykseen ja muuttuneisiin muuttovauhtiin. Kaikki nämä tekijät voivat vaikuttaa lajin selviytymiseen ja säilymiseen42,43. Erytroidipoikkeavuuksien muodostuminen voi viitata sytokineesin estymiseen, mikä johtaa epänormaaliin solunjakautumiseen (kaksitumaiset punasolut)44,45; moniliuskaiset tumakkeet ovat tumakalvon ulkonemia, joissa on useita lohkoja46, kun taas muut erytroidipoikkeavuudet, kuten tuman munuaiset/rakkulat47, voivat liittyä DNA:n monistumiseen. Tumattomat punasolut voivat viitata heikentyneeseen hapenkuljetukseen, erityisesti saastuneessa vedessä48,49. Apoptoosi viittaa solukuolemaan50.
Myös muissa tutkimuksissa on osoitettu sypermetriinin genotoksisia vaikutuksia. Kabaña ym.51 osoittivat mikrotumasolujen ja tumamuutosten, kuten kaksitumaisten solujen ja apoptoosisolujen, esiintymisen Odontophrynus americanus -soluissa sen jälkeen, kun solut altistettiin suurille sypermetriinipitoisuuksille (5000 ja 10 000 μg L−1) 96 tunnin ajan. Sypermetriinin aiheuttamaa apoptoosia havaittiin myös P. biligonigerus52- ja Rhinella arenarum53 -lajeissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sypermetriinillä on genotoksisia vaikutuksia useisiin vesieliöihin ja että MN- ja ENA-määritys voi olla indikaattori subletaaleista vaikutuksista sammakkoeläimiin ja sitä voidaan soveltaa sekä alkuperäislajeihin että luonnonvaraisiin populaatioihin, jotka altistuvat myrkyllisille aineille12.
Kaupalliset sypermetriinin valmisteet aiheuttavat suuren ympäristöriskin (sekä akuutin että kroonisen), ja niiden HQ-arvot ylittävät Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston (EPA) tason54, mikä voi vaikuttaa haitallisesti lajiin, jos niitä esiintyy ympäristössä. Kroonisen riskin arvioinnissa kuolleisuuden NOEC oli 3 μg L−1, mikä vahvistaa, että vedessä havaitut pitoisuudet voivat aiheuttaa riskin lajille55. R. arenarum -toukkien tappava NOEC endosulfaanin ja sypermetriinin seokselle oli 500 μg L−1 168 tunnin kuluttua; tämä arvo laski 0,0005 μg L−1:een 336 tunnin kuluttua. Kirjoittajat osoittavat, että mitä pidempi altistus, sitä alhaisemmat ovat lajille haitalliset pitoisuudet. On myös tärkeää korostaa, että NOEC-arvot olivat korkeammat kuin P. gracilis -toukilla samalla altistusajalla, mikä osoittaa, että lajin vaste sypermetriinille on lajikohtainen. Lisäksi kuolleisuuden osalta P. gracilis -sienen CHQ-arvo sypermetriinille altistumisen jälkeen nousi 64,67:ään, mikä on korkeampi kuin Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston asettama viitearvo54, ja myös R. arenarum -toukkien CHQ-arvo oli tätä arvoa korkeampi (CHQ > 388,00 336 tunnin kuluttua), mikä osoittaa, että tutkitut hyönteismyrkyt aiheuttavat suuren riskin useille sammakkoeläinlajeille. Ottaen huomioon, että P. gracilis tarvitsee noin 30 päivää metamorfoosin loppuunsaattamiseen56, voidaan päätellä, että tutkitut sypermetriinipitoisuudet voivat vaikuttaa populaation vähenemiseen estämällä tartunnan saaneiden yksilöiden siirtymisen aikuis- tai lisääntymisvaiheeseen varhain.
Mikrotumien ja muiden punasolujen tumapoikkeavuuksien laskennallisessa riskinarvioinnissa CHQ-arvot vaihtelivat välillä 14,92–97,00, mikä viittaa siihen, että sypermetriinillä oli mahdollinen genotoksinen riski P. gracilikselle jopa sen luonnollisessa elinympäristössä. Kuolleisuus huomioon ottaen P. graciliksen sietämä vierasaineiden suurin pitoisuus oli 4,24 μg L−1. Jopa 1 μg/l:n pitoisuudet osoittivat kuitenkin myös genotoksisia vaikutuksia. Tämä voi johtaa poikkeavien yksilöiden määrän kasvuun57 ja vaikuttaa lajien kehitykseen ja lisääntymiseen niiden elinympäristöissä, mikä johtaa sammakkoeläinpopulaatioiden vähenemiseen.
Kaupallisilla sypermetriinin hyönteismyrkkyvalmisteilla havaittiin korkeampi akuutti ja krooninen myrkyllisyys P. gracilis -bakteerille. Havaittiin korkeampi kuolleisuus, todennäköisesti myrkyllisten vaikutusten vuoksi, mistä osoituksena olivat mikrotuma- ja punasolujen tumapoikkeavuudet, erityisesti sahalaitaiset tumakkeet, lohkomaiset tumakkeet ja vesikkelitumakkeet. Lisäksi tutkituilla lajeilla havaittiin lisääntyneitä ympäristöriskejä, sekä akuutteja että kroonisia. Nämä tiedot yhdistettynä tutkimusryhmämme aiempiin tutkimuksiin osoittivat, että jopa erilaiset kaupalliset sypermetriinin valmisteet aiheuttivat edelleen asetyylikoliiniesteraasin (AChE) ja butyryylikoliiniesteraasin (BChE) aktiivisuuden vähenemistä ja oksidatiivista stressiä58 sekä johtivat muutoksiin uintiaktiivisuudessa ja suun epämuodostumiin59 P. gracilis -bakteerilla, mikä osoittaa, että kaupallisilla sypermetriinin valmisteilla on korkea letaali ja subletaali myrkyllisyys tälle lajille. Hartmann ym. 60 havaitsivat, että kaupalliset sypermetriinin valmisteet olivat myrkyllisimpiä P. gracilis -bakteerille ja toiselle saman suvun lajille (P. cuvieri) verrattuna yhdeksään muuhun torjunta-aineeseen. Tämä viittaa siihen, että laillisesti hyväksytyt sypermetriinipitoisuudet ympäristönsuojeluun voivat johtaa korkeaan kuolleisuuteen ja pitkäaikaiseen populaation vähenemiseen.
Lisätutkimuksia tarvitaan torjunta-aineen myrkyllisyyden arvioimiseksi sammakkoeläimille, koska ympäristössä havaitut pitoisuudet voivat aiheuttaa korkeaa kuolleisuutta ja olla mahdollinen riski P. gracilis -sienelle. Sammakkoeläinlajeja koskevaa tutkimusta tulisi kannustaa, sillä tietoa näistä eliöistä, erityisesti brasilialaisista lajeista, on niukasti.
Kroonisen myrkyllisyyden testi kesti 168 tuntia (7 päivää) staattisissa olosuhteissa ja subletaalit pitoisuudet olivat: 1, 3, 6 ja 20 μg vaikuttajasolua (AI L−1). Molemmissa kokeissa arvioitiin 10 nuijapäätä käsittelyryhmää kohden kuudessa toistossa, yhteensä 60 nuijapäätä pitoisuutta kohden. Samaan aikaan pelkkä vesikäsittely toimi negatiivisena kontrollina. Jokainen koejärjestely koostui steriilistä lasimaljasta, jonka tilavuus oli 500 ml ja tiheys 1 nuijapää 50 ml:aa liuosta kohden. Pullo peitettiin polyeteenikalvolla haihtumisen estämiseksi ja sitä ilmastettiin jatkuvasti.
Vesi analysoitiin kemiallisesti torjunta-ainepitoisuuksien määrittämiseksi ajankohtina 0, 96 ja 168 tuntia. Sabinin ym. 68 ja Martinsin ym. 69 mukaan analyysit tehtiin Santa Marian liittovaltion yliopiston torjunta-aineanalyysilaboratoriossa (LARP) käyttäen kaasukromatografiaa ja kolmoiskvadrupolimassaspektrometriaa (Varian model 1200, Palo Alto, Kalifornia, USA). Torjunta-aineiden kvantitatiivinen määritys vedessä on esitetty lisämateriaalina (taulukko SM1).
Mikrotumatestiä (MNT) ja punasolujen tumapoikkeavuustestiä (RNA) varten analysoitiin 15 nuijapäätä kustakin käsittelyryhmästä. Nuijapäät nukutettiin 5-prosenttisella lidokaiinilla (50 mg g-170) ja verinäytteet kerättiin sydänpunktiolla kertakäyttöisillä heparinoiduilla ruiskuilla. Verinäytteet valmistettiin steriileille mikroskooppilaseille, ilmakuivattiin, fiksoitiin 100-prosenttisella metanolilla (4 °C) 2 minuutin ajan ja värjättiin sitten 10-prosenttisella Giemsa-liuoksella 15 minuutin ajan pimeässä. Prosessin päätteeksi lasilevyt pestiin tislatulla vedellä ylimääräisen värjäyksen poistamiseksi ja kuivattiin huoneenlämmössä.
Vähintään 1000 punasolua kustakin nuijapäästä analysoitiin 100× mikroskoopilla, jossa oli 71-kertainen objektiivi, MN:n ja ENA:n esiintymisen määrittämiseksi. Yhteensä 75 796 punasolua nuijapäistä arvioitiin ottaen huomioon sypermetriinipitoisuudet ja kontrollit. Genotoksisuus analysoitiin Carrasco et al.:n ja Fenech et al.38,72:n menetelmän mukaisesti määrittämällä seuraavien tumavaurioiden esiintymistiheys: (1) tumattomat solut: solut ilman tumaa; (2) apoptoosisolut: tuman fragmentoituminen, ohjelmoitu solukuolema; (3) kaksitumaiset solut: solut, joissa on kaksi tumaa; (4) tuman silmut tai rakkulasolut: solut, joiden ytimessä on pieniä kohoumia tumakalvossa, rakkulat, jotka ovat kooltaan samanlaisia kuin mikrotumakkeet; (5) karyolysoituneet solut: solut, joissa on vain tuman ääriviivat ilman sisäistä materiaalia; (6) lovisolut: solut, joiden ytimessä on selviä halkeamia tai lovia, joita kutsutaan myös munuaisenmuotoisiksi tumiksi; (7) lobuloidut solut: solut, joiden tumaulokkeet ovat suurempia kuin edellä mainitut vesikkelit; ja (8) mikrosolut: solut, joilla on tiivistynyt tuma ja pienentynyt sytoplasma. Muutoksia verrattiin negatiivisten kontrollien tuloksiin.
Akuutin myrkyllisyyden testitulokset (LC50) analysoitiin GBasic-ohjelmistolla ja TSK-Trimmed Spearman-Karber -menetelmällä74. Kroonisen myrkyllisyyden testidatalle tehtiin ennakkotesti virheen normaaliuden (Shapiro-Wilks) ja varianssin homogeenisuuden (Bartlett) suhteen. Tulokset analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysia (ANOVA). Tukeyn testiä käytettiin tietojen vertailuun keskenään ja Dunnettin testiä käytettiin tietojen vertailuun hoitoryhmän ja negatiivisen kontrolliryhmän välillä.
LOEC- ja NOEC-tiedot analysoitiin Dunnettin testillä. Tilastolliset testit suoritettiin Statistica 8.0 -ohjelmistolla (StatSoft) 95 %:n merkitsevyystasolla (p < 0,05).
Julkaisun aika: 13.3.2025