Tässä tutkimuksessa arvioitiin kaupallisten tuotteiden kuolleisuutta, subkuolleisuutta ja myrkyllisyyttäsypermetriiniformulaatioita anuran-nuijapäille. Akuuttitestissä testattiin pitoisuuksia 100–800 μg/l 96 tunnin ajan. Kroonisessa testissä tutkittiin luonnossa esiintyvien sypermetriinin pitoisuuksien (1, 3, 6 ja 20 µg/l) kuolleisuutta, minkä jälkeen suoritettiin mikrotumatestaus ja punasolujen ydinpoikkeavuudet 7 päivän ajan. Kaupallisen sypermetriinivalmisteen LC50 nuijapäille oli 273,41 μg L-1. Kroonisessa testissä suurin pitoisuus (20 µg L−1) johti yli 50 %:n kuolleisuuteen, koska se tappoi puolet testatuista nuijapäistä. Mikrotumatesti osoitti merkittäviä tuloksia annoksilla 6 ja 20 µg L−1, ja useita tuman poikkeavuuksia havaittiin, mikä viittaa siihen, että kaupallisella sypermetriiniformulaatiolla on genotoksisuutta P. gracilista vastaan. Sypermetriini on suuri riski tälle lajille, mikä osoittaa, että se voi aiheuttaa useita ongelmia ja vaikuttaa tämän ekosysteemin dynamiikkaan lyhyellä ja pitkällä aikavälillä. Tästä syystä voidaan päätellä, että kaupallisilla sypermetriiniformulaatioilla on toksisia vaikutuksia P. gracilikselle.
Maatalouden jatkuvan laajentamisen ja intensiivisen käytön vuoksituholaistorjuntavesieläimet altistuvat usein torjunta-aineille1,2. Maatalouspeltojen lähellä olevien vesivarojen saastuminen voi vaikuttaa muiden kuin kohdeorganismien, kuten sammakkoeläinten, kehitykseen ja selviytymiseen.
Sammakkoeläimet ovat yhä tärkeämpiä ympäristömatriisien arvioinnissa. Anuraaneja pidetään hyvinä ympäristön saasteiden bioindikaattoreina niiden ainutlaatuisten ominaisuuksien, kuten monimutkaisen elinkaaren, nopean toukkien kasvunopeuden, trofisen tilan, läpäisevän ihon10,11, lisääntymisveden riippuvuuden12 ja suojaamattomien munien11,13,14, vuoksi. Pieni vesisammakko (Physalaemus gracilis), joka tunnetaan yleisesti itkevänä sammakkona, on osoitettu torjunta-ainesaasteen bioindikaattorilajiksi4,5,6,7,15. Laji esiintyy seisovilla vesillä, suojelualueilla tai vaihtelevan elinympäristön alueilla Argentiinassa, Uruguayssa, Paraguayssa ja Brasiliassa1617, ja sitä pidetään IUCN-luokituksen mukaan vakaana sen laajan levinneisyyden ja eri elinympäristöjen sietokyvyn vuoksi18.
Sammakkoeläimissä on raportoitu sypermetriinille altistumisen jälkeen aiheuttamia subletaalisia vaikutuksia, mukaan lukien käyttäytymis-, morfologiset ja biokemialliset muutokset nuijapäissä23,24,25, muuttunut kuolleisuus ja metamorfoosiaika, entsymaattiset muutokset, heikentynyt kuoriutuminen24,25, hyperaktiivisuus26, uintikyvyn estyminen27 ja2. Tutkimukset sypermetriinin genotoksisista vaikutuksista sammakkoeläimiin ovat kuitenkin rajallisia. Siksi on tärkeää arvioida anuraanilajien herkkyys sypermetriinille.
Ympäristön saastuminen vaikuttaa sammakkoeläinten normaaliin kasvuun ja kehitykseen, mutta vakavin haittavaikutus on torjunta-ainealtistuksen aiheuttama geneettinen DNA-vaurio13. Verisolujen morfologinen analyysi on tärkeä saastumisen ja aineen mahdollisen myrkyllisyyden bioindikaattori luonnonvaraisille lajeille29. Mikrotumatesti on yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä ympäristön kemikaalien genotoksisuuden määrittämiseksi30. Se on nopea, tehokas ja halpa menetelmä, joka on hyvä indikaattori organismien, kuten sammakkoeläinten, kemiallisesta saastumisesta31,32 ja voi antaa tietoa altistumisesta genotoksisille epäpuhtauksille33.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida kaupallisten sypermetriinivalmisteiden myrkyllistä potentiaalia pienille vedessä eläville nuijapäille käyttämällä mikrotumatestiä ja ekologista riskinarviointia.
P. gracilis -nuijapäiden kumulatiivinen kuolleisuus (%), jotka on altistettu erilaisille kaupallisen sypermetriinin pitoisuuksille testin akuutin ajanjakson aikana.
P. gracilis -nuijapäiden kumulatiivinen kuolleisuus (%) altistuneille kaupallisen sypermetriinin erilaisille pitoisuuksille kroonisen testin aikana.
Havaittu korkea kuolleisuus johtui genotoksisista vaikutuksista sammakkoeläimissä, jotka olivat altistuneet erilaisille sypermetriinin pitoisuuksille (6 ja 20 µg/l), mistä on osoituksena mikrotumien (MN) esiintyminen ja tuman poikkeavuudet erytrosyyteissä. MN:n muodostuminen osoittaa virheitä mitoosissa ja liittyy kromosomien huonoon sitoutumiseen mikrotubuluksiin, kromosomien sisäänoton ja kuljetuksesta vastaavien proteiinikompleksien virheisiin, virheisiin kromosomien segregaatiossa ja virheisiin DNA-vaurion korjaamisessa38, 39 ja se voi liittyä torjunta-aineiden aiheuttamaan oksidatiiviseen stressiin40, 41. Muita poikkeavuuksia havaittiin kaikissa arvioiduissa pitoisuuksissa. Kasvavat sypermetriinipitoisuudet lisäsivät punasolujen tuman poikkeavuuksia 5 % ja 20 % pienimmällä (1 μg/l) ja suurimmalla (20 μg/l) annoksilla. Esimerkiksi lajin DNA:n muutoksilla voi olla vakavia seurauksia sekä lyhyen että pitkän aikavälin selviytymiseen, mikä johtaa populaation vähenemiseen, lisääntymiskunnon muuttumiseen, sisäsiitostukseen, geneettisen monimuotoisuuden menettämiseen ja muuttomäärien muuttumiseen. Kaikki nämä tekijät voivat vaikuttaa lajien selviytymiseen ja säilymiseen42,43. Erytroidisten poikkeavuuksien muodostuminen voi viitata sytokineesin estymiseen, mikä johtaa epänormaaliin solunjakautumiseen (kaksitumaiset punasolut)44,45; moniliuskaiset ytimet ovat tumakalvon ulkonemia, joissa on useita lohkoja46, kun taas muut erytroidiset poikkeavuudet voivat liittyä DNA:n monistumiseen, kuten tuman munuaiset/rakkulat47. Tumallisten punasolujen esiintyminen voi viitata heikentyneeseen hapen kuljetukseen, erityisesti saastuneessa vedessä48,49. Apoptoosi osoittaa solukuoleman50.
Muut tutkimukset ovat myös osoittaneet sypermetriinin genotoksiset vaikutukset. Kabaña et al.51 osoittivat mikrotumien ja tumamuutosten, kuten kaksitumaisten solujen ja apoptoottisten solujen, esiintymisen Odontophrynus americanus -soluissa sen jälkeen, kun niitä oli altistettu korkeille sypermetriinin pitoisuuksille (5000 ja 10 000 µg L−1) 96 tunnin ajan. Sypermetriinin aiheuttama apoptoosi havaittiin myös P. biligonigerus52:ssa ja Rhinella arenarum53:ssa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sypermetriinillä on genotoksisia vaikutuksia useisiin vesieliöihin ja että MN- ja ENA-määritys voi olla merkki subletaalisista vaikutuksista sammakkoeläimiin ja sitä voidaan soveltaa myrkyllisille aineille altistuviin alkuperäislajeihin ja luonnonvaraisiin populaatioihin12.
Kaupalliset sypermetriinin formulaatiot aiheuttavat suuren ympäristövaaran (sekä akuutin että kroonisen), ja pääkonttorit ylittävät Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston (EPA) tason54, mikä voi vaikuttaa haitallisesti lajeihin, jos niitä esiintyy ympäristössä. Kroonisessa riskinarvioinnissa kuolleisuuden NOEC oli 3 μg L−1, mikä vahvistaa, että vedestä löydetyt pitoisuudet voivat aiheuttaa riskin lajeille55. Endosulfaanin ja sypermetriinin seokselle altistuneiden R. arenarum -toukkien tappava NOEC oli 500 μg L−1 168 tunnin jälkeen; tämä arvo laski arvoon 0,0005 μg L−1 336 tunnin jälkeen. Kirjoittajat osoittavat, että mitä pidempi altistuminen on, sitä pienemmät ovat lajille haitalliset pitoisuudet. On myös tärkeää korostaa, että NOEC-arvot olivat korkeammat kuin P. gracilisin arvot samalla altistusajalla, mikä osoittaa, että lajivaste sypermetriinille on lajikohtaista. Lisäksi kuolleisuuden osalta P. graciliksen CHQ-arvo sypermetriinille altistuksen jälkeen saavutti arvon 64,67, mikä on korkeampi kuin Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston asettama viitearvo54, ja myös R. arenarum -toukkien CHQ-arvo oli tätä arvoa korkeampi (CHQ > 388,00 336 tunnin jälkeen), mikä viittaa siihen, että useille tutkituille pofibiinilajeille on suuri riski. Ottaen huomioon, että P. gracilis vaatii noin 30 päivää muodonmuutoksen loppuun saattamiseen56, voidaan päätellä, että tutkitut sypermetriinin pitoisuudet voivat myötävaikuttaa populaation vähenemiseen estämällä tartunnan saaneita yksilöitä pääsemästä aikuisuuteen tai lisääntymisvaiheeseen varhaisessa iässä.
Mikrotumien ja muiden erytrosyyttien tuman poikkeavuuksien laskennallisessa riskiarvioinnissa CHQ-arvot vaihtelivat välillä 14,92-97,00, mikä osoittaa, että sypermetriinillä oli mahdollinen genotoksinen riski P. gracilikselle jopa sen luonnollisessa elinympäristössä. Kuolleisuus huomioon ottaen P. gracilikselle siedettävien ksenobioottisten yhdisteiden enimmäispitoisuus oli 4,24 μg L−1. Kuitenkin niinkin alhaiset pitoisuudet kuin 1 µg/l osoittivat myös genotoksisia vaikutuksia. Tämä tosiasia voi johtaa epänormaalien yksilöiden määrän kasvuun57 ja vaikuttaa lajien kehitykseen ja lisääntymiseen niiden elinympäristöissä, mikä johtaa sammakkoeläinpopulaatioiden vähenemiseen.
Insektisidin sypermetriinin kaupalliset formulaatiot osoittivat suurta akuuttia ja kroonista toksisuutta P. gracilikselle. Todettiin korkeampi kuolleisuus, joka todennäköisesti johtui toksisista vaikutuksista, mistä on osoituksena mikrotumien ja punasolujen tuman poikkeavuudet, erityisesti sahalaitaiset ytimet, lohkoytimet ja rakkulaytimet. Lisäksi tutkitut lajit osoittivat lisääntyneitä ympäristöriskejä, sekä akuutteja että kroonisia. Nämä tiedot yhdistettynä tutkimusryhmämme aikaisempiin tutkimuksiin osoittivat, että jopa erilaiset kaupalliset sypermetriinin formulaatiot aiheuttivat edelleen asetyylikoliiniesteraasin (AChE) ja butyryylikoliiniesteraasin (BChE) toiminnan vähentymistä ja oksidatiivista stressiä58 ja johtivat muutoksiin uintiaktiivisuudessa ja suun epämuodostumissa59 P. gracilis -bakteerissa, mikä viittaa siihen, että tällä kaupallisella myrkyllisyydellä ja letaalilla aineella on erittäin myrkyllisiä. Hartmann et ai. 60 havaitsi, että kaupalliset sypermetriinin formulaatiot olivat myrkyllisimpiä P. gracilikselle ja toiselle saman suvun lajille (P. cuvieri) verrattuna yhdeksään muuhun torjunta-aineeseen. Tämä viittaa siihen, että ympäristönsuojelua varten laillisesti hyväksytyt sypermetriinin pitoisuudet voivat johtaa korkeaan kuolleisuuteen ja pitkäaikaiseen väestön vähenemiseen.
Lisätutkimuksia tarvitaan torjunta-aineen myrkyllisyyden arvioimiseksi sammakkoeläimille, koska ympäristössä havaitut pitoisuudet voivat aiheuttaa suurta kuolleisuutta ja muodostaa mahdollisen riskin P. gracilikselle. Sammakkoeläinlajien tutkimusta olisi kannustettava, koska tietoja näistä organismeista on niukasti, erityisesti brasilialaislajeista.
Krooninen toksisuustesti kesti 168 tuntia (7 päivää) staattisissa olosuhteissa ja subletaalit pitoisuudet olivat: 1, 3, 6 ja 20 μg ai L−1. Molemmissa kokeissa 10 nuijapäistä hoitoryhmää kohden arvioitiin kuudella toistolla, yhteensä 60 nuijapäistä pitoisuutta kohti. Samaan aikaan pelkkä vesikäsittely toimi negatiivisena kontrollina. Kukin kokeellinen järjestely koostui steriilistä lasimaljasta, jonka tilavuus oli 500 ml ja tiheys 1 nuijapää 50 ml liuosta kohti. Pullo peitettiin polyeteenikalvolla haihtumisen estämiseksi ja sitä ilmastettiin jatkuvasti.
Vesi analysoitiin kemiallisesti torjunta-ainepitoisuuksien määrittämiseksi 0, 96 ja 168 tunnin kohdalla. Sabin et al. 68 ja Martins et ai. 69, analyysit suoritettiin Santa Marian liittovaltion yliopiston Pesticide Analysis Laboratoryssa (LARP) käyttäen kaasukromatografiaa yhdistettynä kolminkertaisen kvadrupolin massaspektrometriaan (Varian malli 1200, Palo Alto, Kalifornia, USA). Lisämateriaalina on esitetty vedessä olevien torjunta-aineiden määrällinen määritys (taulukko SM1).
Mikrotumatestiä (MNT) ja punasolujen ydinpoikkeavuustestiä (RNA) varten analysoitiin 15 nuijapäistä kustakin hoitoryhmästä. Nukkuvat nukutettiin 5 % lidokaiinilla (50 mg g-170) ja verinäytteet otettiin sydänpunktiolla käyttämällä kertakäyttöisiä heparinisoituja ruiskuja. Verinäytteet valmistettiin steriileille mikroskoopin objektilaseille, ilmakuivattiin, kiinnitettiin 100-prosenttisella metanolilla (4 °C) 2 minuutin ajan ja värjättiin sitten 10-prosenttisella Giemsa-liuoksella 15 minuutin ajan pimeässä. Prosessin lopussa objektilasit pestiin tislatulla vedellä ylimääräisen tahran poistamiseksi ja kuivattiin huoneenlämpötilassa.
Ainakin 1000 punasolua kustakin nuijapäästä analysoitiin käyttämällä 100-kertaista mikroskooppia 71-objektiivilla MN:n ja ENA:n läsnäolon määrittämiseksi. Yhteensä 75 796 nuijapäiden punasolua arvioitiin ottaen huomioon sypermetriinin pitoisuudet ja kontrollit. Genotoksisuus analysoitiin Carrascon et ai. ja Fenech et ai.38,72 määrittämällä seuraavien tumavaurioiden esiintymistiheys: (1) tumasolut: solut, joissa ei ole tumia; (2) apoptoottiset solut: tuman fragmentoituminen, ohjelmoitu solukuolema; (3) kaksitumaiset solut: solut, joissa on kaksi tumaa; (4) tumansilmut tai rakkulasolut: solut, joissa on tumat, joissa on pieniä ulokkeita tumakalvossa, rakkuloita, jotka ovat kooltaan samanlaisia kuin mikrotumat; (5) karyolysoidut solut: solut, joissa on vain ytimen ääriviivat ilman sisäistä materiaalia; (6) lovetut solut: solut, joissa on ytimiä, joissa on ilmeisiä halkeamia tai lovia muodossaan, joita kutsutaan myös munuaisen muotoisiksi ytimiksi; (7) lobuloidut solut: solut, joiden tuman ulkonemat ovat suurempia kuin edellä mainitut vesikkelit; ja (8) mikrosolut: solut, joissa on kondensoituneita ytimiä ja vähentynyt sytoplasma. Muutoksia verrattiin negatiivisten kontrollien tuloksiin.
Akuutin toksisuuden testitulokset (LC50) analysoitiin käyttämällä GBasic-ohjelmistoa ja TSK-Trimmed Spearman-Karber -menetelmää74. Kroonisten testien tulokset esitestattiin virhenormaaliuden (Shapiro-Wilks) ja varianssin homogeenisuuden (Bartlett) suhteen. Tulokset analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA). Tukeyn testiä käytettiin vertailemaan tietoja keskenään ja Dunnettin testiä käytettiin vertailuun hoitoryhmän ja negatiivisen kontrolliryhmän välillä.
LOEC- ja NOEC-tiedot analysoitiin käyttämällä Dunnettin testiä. Tilastolliset testit suoritettiin Statistica 8.0 -ohjelmistolla (StatSoft) merkitsevyystasolla 95 % (p < 0,05).
Postitusaika: 13.3.2025