Synteettisten torjunta-aineiden laaja käyttö on johtanut moniin ongelmiin, kuten resistenttien organismien syntymiseen, ympäristön pilaantumiseen ja ihmisten terveyden vahingoittumiseen. Siksi uudet mikrobittorjunta-aineetIhmisen terveydelle ja ympäristölle turvallisia biosurfaktantteja tarvitaan kiireellisesti. Tässä tutkimuksessa Enterobacter cloacae SJ2:n tuottamaa ramnolipidibiosurfaktanttia käytettiin arvioimaan myrkyllisyyttä hyttysten (Culex quinquefasciatus) ja termiittien (Odontotermes obesus) toukille. Tulokset osoittivat, että käsittelyjen välillä oli annoksesta riippuva kuolleisuus. Termiittien ja hyttysten toukkien biosurfaktanttien LC50-arvo (50 % tappava pitoisuus) 48 tunnin kohdalla määritettiin epälineaarisen regressiokäyrän sovitusmenetelmällä. Tulokset osoittivat, että biosurfaktantin toukkia tappavan ja antitermiittisen vaikutuksen 48 tunnin LC50-arvot (95 %:n luottamusväli) olivat vastaavasti 26,49 mg/l (vaihteluväli 25,40–27,57) ja 33,43 mg/l (vaihteluväli 31,09–35,68). Histopatologisen tutkimuksen mukaan biosurfaktanttien käyttö aiheutti vakavia vaurioita toukkien ja termiittien organellikudoksille. Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että Enterobacter cloacae SJ2:n tuottama mikrobinen biosurfaktantti on erinomainen ja potentiaalisesti tehokas työkalu Cx-bakteerien, quinquefasciatuksen ja O. obesuksen, torjuntaan.
Trooppisissa maissa esiintyy paljon hyttysten levittämiä tauteja1. Hyttysten levittämien tautien merkitys on laajalle levinnyt. Yli 400 000 ihmistä kuolee malariaan vuosittain, ja joissakin suurkaupungeissa esiintyy vakavien tautien, kuten dengue-, keltakuume-, chikungunya- ja zikakuumeen, epidemioita.2 Vektorien levittämät taudit liittyvät joka kuudenteen tartuntaan maailmanlaajuisesti, ja hyttyset aiheuttavat merkittävimmät tapaukset3,4. Culex, Anopheles ja Aedes ovat kolme hyttyssukua, jotka liittyvät yleisimmin tautien leviämiseen5. Denguekuumeen, Aedes aegypti -hyttysen levittämän infektion, esiintyvyys on lisääntynyt viimeisen vuosikymmenen aikana ja aiheuttaa merkittävän kansanterveysuhan4,7,8. Maailman terveysjärjestön (WHO) mukaan yli 40 % maailman väestöstä on denguekuumeen riskiryhmässä, ja 50–100 miljoonaa uutta tapausta ilmenee vuosittain yli 100 maassa9,10,11. Denguekuumeesta on tullut merkittävä kansanterveysongelma, koska sen esiintyvyys on lisääntynyt maailmanlaajuisesti12,13,14. Anopheles gambiae, joka tunnetaan yleisesti afrikkalaisena Anopheles-hyttysena, on tärkein ihmisen malarian levittäjä trooppisilla ja subtrooppisilla alueilla15. Länsi-Niilin virus, St. Louisin enkefaliitti, Japanin enkefaliitti sekä hevosten ja lintujen virusinfektiot levittävät Culex-hyttyset, joita usein kutsutaan tavallisiksi huonehyttysiksi. Lisäksi ne kantavat myös bakteeri- ja loistauteja16. Maailmassa on yli 3 000 termiittilajia, ja niitä on ollut olemassa yli 150 miljoonaa vuotta17. Useimmat tuholaiset elävät maaperässä ja syövät selluloosaa sisältävää puuta ja puutuotteita. Intialainen termiitti Odontotermes obesus on tärkeä tuholainen, joka aiheuttaa vakavaa vahinkoa tärkeille viljelykasveille ja viljelmien puille18. Maatalousalueilla termiittitartunnat eri vaiheissa voivat aiheuttaa valtavia taloudellisia vahinkoja eri viljelykasveille, puulajeille ja rakennusmateriaaleille. Termiitit voivat myös aiheuttaa ihmisille terveysongelmia19.
Mikro-organismien ja tuholaisten vastustuskykyyn liittyvä ongelma on nykypäivän lääke- ja maatalousaloilla monimutkainen20,21. Siksi molempien yritysten tulisi etsiä uusia kustannustehokkaita mikrobilääkkeitä ja turvallisia biotorjunta-aineita. Synteettisiä torjunta-aineita on nyt saatavilla, ja niiden on osoitettu olevan tarttuvia ja karkottavan muita kuin kohdehyönteisiä22. Viime vuosina biosurfaktanttien tutkimus on laajentunut niiden käytön vuoksi eri teollisuudenaloilla. Biosurfaktantit ovat erittäin hyödyllisiä ja elintärkeitä maataloudessa, maaperän kunnostuksessa, öljyntuotannossa, bakteerien ja hyönteisten torjunnassa sekä elintarvikkeiden jalostuksessa23,24. Biosurfaktantit eli mikrobien pinta-aktiiviset aineet ovat biosurfaktantteja, joita mikro-organismit, kuten bakteerit, hiivat ja sienet, tuottavat rannikkoalueiden elinympäristöissä ja öljyn saastuttamilla alueilla25,26. Kemiallisesti johdetut pinta-aktiiviset aineet ja biosurfaktantit ovat kahdenlaisia, joita saadaan suoraan luonnollisesta ympäristöstä27. Erilaisia biosurfaktantteja saadaan merialueilta28,29. Siksi tutkijat etsivät uusia teknologioita luonnollisiin bakteereihin perustuvien biosurfaktanttien tuotantoon30,31. Tällaisen tutkimuksen edistysaskeleet osoittavat näiden biologisten yhdisteiden merkityksen ympäristönsuojelulle32. Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium ja nämä bakteerisuvut ovat hyvin tutkittuja edustajia23,33.
Biosurfaktantteja on monenlaisia, ja niillä on laaja valikoima käyttötarkoituksia34. Näiden yhdisteiden merkittävä etu on, että joillakin niistä on antibakteerisia, toukkia tappavia ja hyönteismyrkkyjä. Tämä tarkoittaa, että niitä voidaan käyttää maatalous-, kemian-, lääke- ja kosmetiikkateollisuudessa35,36,37,38. Koska biosurfaktantit ovat yleensä biohajoavia ja ympäristölle hyödyllisiä, niitä käytetään integroiduissa tuholaistorjuntaohjelmissa viljelykasvien suojelemiseksi39. Näin on saatu perustietoa Enterobacter cloacae SJ2:n tuottamien mikrobien biosurfaktanttien toukkia tappavasta ja termiittejä tappavasta vaikutuksesta. Tutkimme kuolleisuutta ja histologisia muutoksia, kun ne altistettiin eri pitoisuuksille ramnolipidibiosurfaktantteja. Lisäksi arvioimme laajalti käytettyä kvantitatiivista rakenne-aktiivisuus (QSAR) -tietokoneohjelmaa Ecological Structure-Activity (ECOSAR) akuutin myrkyllisyyden määrittämiseksi mikroleville, vesikirpuille ja kaloille.
Tässä tutkimuksessa testattiin puhdistettujen biosurfaktanttien antitermiittiaktiivisuutta (toksisuutta) eri pitoisuuksilla välillä 30–50 mg/ml (5 mg/ml välein) intialaisia termiittejä, O. obesusta ja neljättä lajia vastaan. Arvioi. C. quinquefasciatus -hyttysten toukat. Biosurfaktanttien LC50-pitoisuudet 48 tunnin aikana O. obesusta ja Cx. C. solanacearum -hyttysten vastaan. Hyttysen toukat tunnistettiin epälineaarisen regressiokäyrän sovitusmenetelmällä. Tulokset osoittivat, että termiittien kuolleisuus lisääntyi biosurfaktanttien pitoisuuden kasvaessa. Tulokset osoittivat, että biosurfaktantilla oli toukkia tappava vaikutus (kuva 1) ja termiittejä tuhoava vaikutus (kuva 2), ja 48 tunnin LC50-arvot (95 %:n luottamusväli) olivat 26,49 mg/l (25,40–27,57) ja 33,43 mg/l (kuva 31,09–35,68) (taulukko 1). Akuutin myrkyllisyyden (48 tuntia) osalta biosurfaktantti luokitellaan "haitalliseksi" testatuille organismeille. Tässä tutkimuksessa tuotettu biosurfaktantti osoitti erinomaista toukkia tappavaa vaikutusta ja 100 %:n kuolleisuuden 24–48 tunnin kuluessa altistuksesta.
Laske larvisidisen aktiivisuuden LC50-arvo. Epälineaarisen regressiokäyrän sovitus (yhtenäinen viiva) ja 95 %:n luottamusväli (varjostettu alue) suhteelliselle kuolleisuudelle (%).
Laske LC50-arvo termiittien vastaiselle aktiivisuudelle. Epälineaarisen regressiokäyrän sovitus (yhtenäinen viiva) ja 95 %:n luottamusväli (varjostettu alue) suhteelliselle kuolleisuudelle (%).
Kokeen lopussa mikroskoopilla havaittiin morfologisia muutoksia ja poikkeavuuksia. Morfologisia muutoksia havaittiin kontrolli- ja käsitellyissä ryhmissä 40-kertaisella suurennuksella. Kuten kuvassa 3 on esitetty, kasvun hidastumista esiintyi useimmilla biosurfaktanteilla käsitellyistä toukista. Kuva 3a esittää normaalia Cx. quinquefasciatus -toukkaa, kuva 3b esittää poikkeavaa Cx.:tä. Aiheuttaa viisi sukkulamatojen toukkaa.
Biosurfaktanttien subletaalien (LC50) annosten vaikutus Culex quinquefasciatus -toukkien kehitykseen. Normaalin Cx:n valomikroskopiakuva (a) 40× suurennuksella. quinquefasciatus (b) Epänormaali Cx. Aiheuttaa viisi sukkulamatojen toukkaa.
Tässä tutkimuksessa käsiteltyjen toukkien (kuva 4) ja termiittien (kuva 5) histologinen tutkimus paljasti useita poikkeavuuksia, mukaan lukien vatsan alueen pienenemisen sekä lihasten, epiteelikerrosten ja ihon vaurioita keskisuolessa. Histologia paljasti tässä tutkimuksessa käytetyn biosurfaktantin estävän aktiivisuuden mekanismin.
Normaalien käsittelemättömien neljännen asteen Cx-toukkien, quinquefasciatus-toukkien (kontrolli: (a, b)) ja biosurfaktantilla käsiteltyjen (käsittely: (c, d)), histopatologia. Nuolet osoittavat käsitellyn suolistoepiteelin (epi), tumat (n) ja lihaskudoksen (mu). Pylväs = 50 µm.
Normaalin hoitamattoman O. obesus -bakteerin (kontrolli: (a, b)) ja biosurfaktantilla käsitellyn (käsittely: (c, d)) histopatologia. Nuolet osoittavat suoliston epiteelin (epi) ja lihaskudoksen (mu). Pylväs = 50 µm.
Tässä tutkimuksessa ECOSAR-ohjelmistoa käytettiin ennustamaan ramnolipidien biosurfaktanttien akuuttia myrkyllisyyttä ensisijaisille tuottajille (viherlevät), ensisijaisille kuluttajille (vesikirput) ja toissijaisille kuluttajille (kalat). Tämä ohjelma käyttää kehittyneitä kvantitatiivisia rakenne-aktiivisuusyhdistemalleja myrkyllisyyden arvioimiseksi molekyylirakenteen perusteella. Malli käyttää rakenne-aktiivisuus (SAR) -ohjelmistoa aineiden akuutin ja pitkäaikaisen myrkyllisyyden laskemiseen vesieliölajeille. Taulukossa 2 on yhteenveto useiden lajien arvioiduista keskimääräisistä letaaleista pitoisuuksista (LC50) ja keskimääräisistä tehokkaista pitoisuuksista (EC50). Epäilty myrkyllisyys luokiteltiin neljään tasoon käyttämällä kemikaalien maailmanlaajuisesti harmonisoitua luokitus- ja merkintäjärjestelmää (taulukko 3).
Vektorien levittämien tautien, erityisesti hyttysten ja Aedes-hyttysten kantojen, torjunta. Egyptiläiset tekevät nyt vaikeaa työtä 40,41,42,43,44,45,46. Vaikka jotkut kemiallisesti saatavilla olevat torjunta-aineet, kuten pyretroidit ja organofosfaatit, ovat jossain määrin hyödyllisiä, ne aiheuttavat merkittäviä riskejä ihmisten terveydelle, mukaan lukien diabetes, lisääntymishäiriöt, neurologiset häiriöt, syöpä ja hengityselinsairaudet. Lisäksi ajan myötä näistä hyönteisistä voi tulla niille vastustuskykyisiä 13,43,48. Näin ollen tehokkaista ja ympäristöystävällisistä biologisista torjuntamenetelmistä tulee suositumpi hyttysten torjuntamenetelmä 49,50. Benelli 51 ehdotti, että hyttysten vektorien varhainen torjunta olisi tehokkaampaa kaupunkialueilla, mutta he eivät suositelleet toukkamyrkkyjen käyttöä maaseudulla 52. Tom ym. 53 ehdottivat myös, että hyttysten torjunta niiden kehittymättömissä vaiheissa olisi turvallinen ja yksinkertainen strategia, koska ne ovat herkempiä torjunta-aineille 54.
Tehokkaan kannan (Enterobacter cloacae SJ2) biosurfaktanttien tuotanto osoitti johdonmukaista ja lupaavaa tehokkuutta. Aiemmassa tutkimuksessamme raportoitiin, että Enterobacter cloacae SJ2 optimoi biosurfaktanttien tuotantoa fysikaalis-kemiallisten parametrien avulla26. Heidän tutkimuksensa mukaan optimaaliset olosuhteet biosurfaktanttien tuotannolle potentiaalisella E. cloacae -isolaatilla olivat 36 tunnin inkubointi, ravistelu nopeudella 150 rpm, pH 7,5, 37 °C, suolapitoisuus 1 ppt, 2 % glukoosia hiilenlähteenä ja 1 % hiivaa. Uutetta käytettiin typen lähteenä, jolloin saatiin 2,61 g/l biosurfaktanttia. Lisäksi biosurfaktantit karakterisoitiin käyttämällä TLC:tä, FTIR:ää ja MALDI-TOF-MS:ää. Tämä vahvisti, että ramnolipidi on biosurfaktantti. Glykolipidibiosurfaktantit ovat intensiivisimmin tutkittu luokka muita biosurfaktantteja55. Ne koostuvat hiilihydraatti- ja lipidiosista, pääasiassa rasvahappoketjuista. Glykolipideistä tärkeimmät edustajat ovat ramnolipidi ja soforolipidi56. Ramnolipidit sisältävät kaksi ramnoosiosaa, jotka ovat liittyneet mono- tai di-β-hydroksidekaanihappoon 57. Ramnolipidien käyttö lääketieteen ja lääketeollisuudessa on vakiintunutta 58, ja niitä on äskettäin käytetty torjunta-aineina 59.
Biosurfaktantin vuorovaikutus hengityssifonin hydrofobisen alueen kanssa sallii veden kulkeutua ilmarakojen läpi, mikä lisää toukkien kosketusta vesiympäristön kanssa. Biosurfaktanttien läsnäolo vaikuttaa myös henkitorveen, jonka pituus on lähellä pintaa, mikä helpottaa toukkien ryömimistä pintaan ja hengittämistä. Tämän seurauksena veden pintajännitys pienenee. Koska toukat eivät voi kiinnittyä veden pintaan, ne putoavat säiliön pohjalle, mikä häiritsee hydrostaattista painetta, mikä johtaa liialliseen energiankulutukseen ja hukkumiskuolemaan38,60. Samanlaisia tuloksia sai Ghribi61, jossa Bacillus subtilis -sienen tuottama biosurfaktantti osoitti toukkia tappavaa vaikutusta Ephestia kuehniella -sientä vastaan. Vastaavasti Cx. Dasin ja Mukherjeen23 toukkia tappava vaikutus arvioitiin myös syklisten lipopeptidien vaikutusta quinquefasciatus-toukkiin.
Tämän tutkimuksen tulokset koskevat ramnolipidibiosurfaktanttien toukkia tappavaa vaikutusta Cx-suvun lajeja vastaan. Quinquefasciatus-hyttysten tappaminen on yhdenmukaista aiemmin julkaistujen tulosten kanssa. Esimerkiksi käytetään Bacillus-suvun eri bakteerien tuottamia surfaktiinipohjaisia biosurfaktantteja. ja Pseudomonas spp. Joissakin varhaisissa raporteissa64,65,66 raportoitiin Bacillus subtilis -bakteerin lipopeptidibiosurfaktanttien toukkia tappavasta vaikutuksesta23. Deepali ym.63 havaitsivat, että Stenotropomonas maltophilia -bakteerista eristetyllä ramnolipidibiosurfaktantilla oli voimakas toukkia tappava vaikutus 10 mg/l pitoisuudella. Silva ym.67 raportoivat ramnolipidibiosurfaktantin toukkia tappavasta vaikutuksesta Ae-sientä vastaan 1 g/l pitoisuudella. Aedes aegypti. Kanakdande ym.68 raportoivat, että Bacillus subtilis -bakteerin tuottamat lipopeptidibiosurfaktantit aiheuttivat kokonaiskuolleisuutta Culex-toukissa ja termiiteissä eukalyptuksen lipofiilisen fraktion avulla. Samoin Masendra ym. 69 raportoivat työmuurahaisten (Cryptotermes cynocephalus Light.) kuolleisuudeksi 61,7 % E.-raakauutteen lipofiilisissä n-heksaani- ja EtOAc-fraktioissa.
Parthipan ym. 70 raportoivat Bacillus subtilis A1:n ja Pseudomonas stutzeri NA3:n tuottamien lipopeptidibiosurfaktanttien hyönteismyrkkykäytöstä Anopheles Stephensiä, malariaparasiitti Plasmodiumin vektoria, vastaan. He havaitsivat, että toukat ja kotelot selvisivät pidempään, niillä oli lyhyempi muninta-aika, ne olivat steriilejä ja niiden elinikä lyheni, kun niitä käsiteltiin eri biosurfaktanttipitoisuuksilla. B. subtilis biosurfaktantin A1 havaitut LC50-arvot olivat 3,58, 4,92, 5,37, 7,10 ja 7,99 mg/l eri toukkavaiheissa (eli toukat I, II, III, IV ja kotelovaiheet). Vertailun vuoksi Pseudomonas stutzeri NA3:n toukkavaiheiden I-IV ja kotelovaiheiden biosurfaktantit olivat 2,61, 3,68, 4,48, 5,55 ja 6,99 mg/l. Eloonjääneiden toukkien ja koteloiden viivästyneen fenologian uskotaan johtuvan hyönteismyrkkykäsittelyjen aiheuttamista merkittävistä fysiologisista ja aineenvaihduntahäiriöistä71.
Wickerhamomyces anomalus -kanta CCMA 0358 tuottaa biosurfaktanttia, jolla on 100 %:n toukkia tappava vaikutus Aedes-hyttysiä vastaan. aegyptin 24 tunnin välein mitattu arvo 38 oli korkeampi kuin Silvan ym. raportoimat arvot. Pseudomonas aeruginosa -bakteerista auringonkukkaöljyä hiilenlähteenä käyttäen tuotetun biosurfaktantin on osoitettu tappavan 100 % toukista 48 tunnin kuluessa 67. Abinaya ym.72 ja Pradhan ym.73 osoittivat myös useiden Bacillus-suvun isolaattien tuottamien pinta-aktiivisten aineiden toukkia tai hyönteisiä tappavat vaikutukset. Senthil-Nathanin ym. aiemmin julkaisemassa tutkimuksessa havaittiin, että 100 % kasvilaguuneille altistuneista hyttysen toukista todennäköisesti kuoli. 74.
Hyönteismyrkkyjen subletaalien vaikutusten arviointi hyönteisten biologiaan on kriittistä integroiduille tuholaistorjuntaohjelmille, koska subletaalit annokset/pitoisuudet eivät tapa hyönteisiä, mutta voivat vähentää hyönteispopulaatioita tulevissa sukupolvissa häiritsemällä biologisia ominaisuuksia10. Siqueira ym. 75 havaitsivat ramnolipidibiosurfaktantin (300 mg/ml) täydellisen toukkia tappavan vaikutuksen (100 % kuolleisuus) testattaessa eri pitoisuuksilla välillä 50–300 mg/ml. Aedes aegypti -kantojen toukkavaihe. He analysoivat kuolemaan kuluvan ajan ja subletaalien pitoisuuksien vaikutuksia toukkien selviytymiseen ja uintiaktiivisuuteen. Lisäksi he havaitsivat uintinopeuden hidastumista 24–48 tunnin altistuksen jälkeen biosurfaktantin subletaalisille pitoisuuksille (esim. 50 mg/ml ja 100 mg/ml). Myrkkyjen, joilla on lupaavia subletaaleja vaikutuksia, uskotaan olevan tehokkaampia aiheuttamaan moninkertaisia vaurioita altistuneille tuholaisille76.
Tulostemme histologiset havainnot osoittavat, että Enterobacter cloacae SJ2:n tuottamat biosurfaktantit muuttavat merkittävästi hyttysen (Cx. quinquefasciatus) ja termiitin (O. obesus) toukkien kudoksia. Samanlaisia poikkeavuuksia aiheuttivat basilikaöljyvalmisteet An. gambiaes.s- ja An. arabica -toukissa, ja Ochola77 kuvasi. Kamaraj ym.78 kuvasivat myös samoja morfologisia poikkeavuuksia An:ssa. Stephanien toukat altistettiin kultananopartikkeleille. Vasantha-Srinivasan ym.79 raportoivat myös, että paimenen kukkarosta saaneen eteerisen öljyn vaurioittivat vakavasti Aedes albopictus -sienen kammiota ja epiteelikerroksia. Aedes aegypti -sienillä on vakavia histologisia vaurioita. Raghavendran ym. raportoivat, että hyttysen toukkia käsiteltiin 500 mg/ml paikallisen Penicillium-sienen rihmastoutteella. Ae:lla on vakavia histologisia vaurioita. aegypti ja Cx. Kuolleisuus 80. Aiemmin Abinaya ym. tutkivat An:n neljännen vaiheen toukkia. Stephensi ja Ae. aegypti havaitsi lukuisia histologisia muutoksia B. licheniformis -eksopolysakkarideilla käsitellyissä Aedes aegypti -hyttysten toukissa, mukaan lukien mahalaukun umpisuoli, lihasatrofiaa, hermosolmujen vaurioita ja hajoamista72. Raghavendranin ym. mukaan testattujen hyttysten (neljännen vaiheen toukat) keskisuolen soluissa havaittiin P. daleae -rihmastouutteella käsittelyn jälkeen suoliston luumenin turvotusta, solujen välisen sisällön vähenemistä ja tuman rappeutumista81. Samat histologiset muutokset havaittiin punahattulehtiuutteella käsitellyissä hyttysen toukissa, mikä viittaa käsiteltyjen yhdisteiden hyönteismyrkkyvaikutukseen50.
ECOSAR-ohjelmistojen käyttö on saanut kansainvälistä tunnustusta82. Nykytutkimukset viittaavat siihen, että ECOSAR-biosurfaktanttien akuutti myrkyllisyys mikroleville (C. vulgaris), kaloille ja vesikirpuille (D. magna) kuuluu Yhdistyneiden Kansakuntien määrittelemään "myrkyllisyys"-kategoriaan83. ECOSAR-ekotoksisuusmalli käyttää SAR- ja QSAR-menetelmiä aineiden akuutin ja pitkäaikaisen myrkyllisyyden ennustamiseen, ja sitä käytetään usein orgaanisten epäpuhtauksien myrkyllisyyden ennustamiseen82,84.
Paraformaldehydi, natriumfosfaattipuskuri (pH 7,4) ja kaikki muut tässä tutkimuksessa käytetyt kemikaalit ostettiin HiMedia Laboratoriesilta, Intiasta.
Biosurfaktanttien tuotanto suoritettiin 500 ml:n Erlenmeyer-pulloissa, jotka sisälsivät 200 ml steriiliä Bushnell Haas -elatusainetta, johon oli lisätty 1 % raakaöljyä ainoana hiilenlähteenä. Enterobacter cloacae SJ2 -esiviljelmä (1,4 × 104 CFU/ml) inokuloitiin ja viljeltiin orbitaalisessa ravistelijassa 37 °C:ssa, 200 rpm:ssä 7 päivän ajan. Inkubointijakson jälkeen biosurfaktantti uutettiin sentrifugoimalla viljelyalustaa 3400 × g:n voimalla 20 minuutin ajan 4 °C:ssa, ja tuloksena olevaa supernatanttia käytettiin seulontatarkoituksiin. Biosurfaktanttien optimointimenetelmät ja karakterisointi otettiin käyttöön aiemmasta tutkimuksestamme26.
Culex quinquefasciatus -toukat saatiin Center for Advanced Study in Marine Biology (CAS) -laitokselta Palanchipetai'ssa, Tamil Nadussa (Intia). Toukkia kasvatettiin deionisoidulla vedellä täytetyissä muoviastioissa 27 ± 2 °C:n lämpötilassa ja 12:12-sekundisen valojakson (valo:pimeä) mukaisesti. Hyttystoukille syötettiin 10-prosenttista glukoosiliuosta.
Culex quinquefasciatus -toukkia on löydetty avoimista ja suojaamattomista septitankeista. Käytä toukkien tunnistamiseen ja viljelyyn laboratoriossa standardoituja luokitteluohjeita85. Toukkien torjunta-aineet tehtiin Maailman terveysjärjestön 86 suositusten mukaisesti. SH. Quinquefasciatus-toukkien neljännen vaiheen toukat kerättiin suljettuihin putkiin 25 ml:n ja 50 ml:n ryhmissä, joissa oli kaksi kolmasosaa niiden tilavuudesta. Biosurfaktanttia (0–50 mg/ml) lisättiin jokaiseen putkeen erikseen ja säilytettiin 25 °C:ssa. Kontrolliputkessa käytettiin vain tislattua vettä (50 ml). Kuolleiksi toukiksi katsottiin ne, jotka eivät osoittaneet uinnin merkkejä inkubointijakson (12–48 tuntia) aikana 87. Laske toukkien kuolleisuusprosentti yhtälöllä (1)88.
Odontotermitidae-heimoon kuuluu intialainen termiitti Odontotermes obesus, jota tavataan lahoavista tukeista maatalouskampuksella (Annamalai University, Intia). Testaa tätä biosurfaktanttia (0–50 mg/ml) normaaleilla menetelmillä sen haitallisuuden määrittämiseksi. Laminaari-ilmavirrassa 30 minuutin kuivaamisen jälkeen jokainen Whatman-paperisuikale päällystettiin biosurfaktantilla pitoisuudella 30, 40 tai 50 mg/ml. Esipäällystettyjä ja päällystämättömiä paperisuikaleita testattiin ja verrattiin petrimaljan keskellä. Jokainen petrimalja sisältää noin kolmekymmentä aktiivista termiittiä O. obesus. Kontrolli- ja testitermiiteille annettiin märkää paperia ravinnoksi. Kaikkia levyjä pidettiin huoneenlämmössä koko inkubointiajan. Termiitit kuolivat 12, 24, 36 ja 48 tunnin kuluttua89,90. Yhtälöä 1 käytettiin sitten termiittien kuolleisuusprosentin arvioimiseen eri biosurfaktanttipitoisuuksilla. (2).
Näytteet säilytettiin jäissä ja pakattiin mikroputkiin, jotka sisälsivät 100 ml 0,1 M natriumfosfaattipuskuria (pH 7,4), ja lähetettiin Rajiv Gandhi Center for Aquacultureen (RGCA) Central Aquaculture Pathology Laboratoryyn (CAPL). Histology Laboratory sijaitsee Sirkalissa, Mayiladuthurai'n piirikunnassa, Tamil Nadussa, Intiassa jatkotutkimuksia varten. Näytteet fiksoitiin välittömästi 4 % paraformaldehydissä 37 °C:ssa 48 tuntia.
Kiinnitysvaiheen jälkeen materiaali pestiin kolme kertaa 0,1 M natriumfosfaattipuskurilla (pH 7,4), kuivattiin vaiheittain etanolissa ja liotettiin LEICA-hartsissa 7 päivän ajan. Aine asetettiin sitten hartsilla ja polymerointiaineella täytettyyn muovimuottiin ja sitten 37 °C:een lämmitettyyn uuniin, kunnes ainetta sisältävä lohko oli täysin polymeroitunut.
Polymeroinnin jälkeen lohkot leikattiin LEICA RM2235 -mikrotomilla (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, USA) 3 mm:n paksuisiksi paloiksi. Leikkeet ryhmiteltiin laseille, kuusi leikettä lasilevyä kohden. Lasilevyt kuivattiin huoneenlämmössä, värjättiin sitten hematoksyliinillä 7 minuutin ajan ja pestiin juoksevalla vedellä 4 minuutin ajan. Lisäksi iholle levitettiin eosiiniliuosta 5 minuutin ajan ja huuhdeltiin juoksevalla vedellä 5 minuutin ajan.
Akuuttia myrkyllisyyttä ennustettiin käyttämällä eri trooppisilla tasoilla eläviä vesieliöitä: 96 tunnin LC50 kaloille, 48 tunnin LC50 D. magnalle ja 96 tunnin EC50 viherleville. Ramnolipidien biosurfaktanttien myrkyllisyyttä kaloille ja viherleville arvioitiin käyttämällä Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston kehittämää ECOSAR-ohjelmistoversiota 2.2 Windowsille. (Saatavilla verkossa osoitteessa https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
Kaikki toukkien ja termiittien tuhoamisvaikutuksen testit tehtiin kolmena rinnakkaismäärityksenä. Toukkien ja termiittien kuolleisuustiedoille tehtiin epälineaarinen regressio (annos-vastemuuttujien logaritmi) mediaanin letaalisuuden (LC50) laskemiseksi 95 %:n luottamusvälillä, ja pitoisuus-vastekäyrät luotiin käyttämällä Prism®-ohjelmistoa (versio 8.0, GraphPad Software) Inc., USA) 84, 91.
Tämä tutkimus paljastaa Enterobacter cloacae SJ2:n tuottamien mikrobisten biosurfaktanttien potentiaalin hyttysten toukkia tappavina ja antitermiittisinä aineina, ja tämä työ edistää toukkia ja antitermiittisiä vaikutusmekanismeja paremman ymmärtämisen saavuttamista. Biosurfaktanteilla käsiteltyjen toukkien histologiset tutkimukset osoittivat vaurioita ruoansulatuskanavassa, keskisuolessa ja aivokuoressa sekä suoliston epiteelisolujen hyperplasiaa. Tulokset: Enterobacter cloacae SJ2:n tuottaman ramnolipidibiosurfaktantin antitermiitti- ja toukkia tappavan vaikutuksen toksikologinen arviointi osoitti, että tämä isolaatti on potentiaalinen biotorjunta-aine hyttysten (Cx quinquefasciatus) ja termiittien (O. obesus) vektorivälitteisten tautien torjuntaan. On tarpeen ymmärtää biosurfaktanttien taustalla oleva ympäristötoksisuus ja niiden mahdolliset ympäristövaikutukset. Tämä tutkimus tarjoaa tieteellisen perustan biosurfaktanttien ympäristöriskin arvioinnille.
Julkaisun aika: 09.04.2024