Guizhoun maakunnan sademäärän kausittainen jakautuminen on epätasainen, ja keväällä ja kesällä sataa enemmän, mutta rypsin taimet ovat alttiita kuivuusstressille syksyllä ja talvella, mikä vaikuttaa vakavasti satoon. Sinappi on erityinen öljykasvi, jota viljellään pääasiassa Guizhoun maakunnassa. Sillä on vahva kuivuudensietokyky ja sitä voidaan viljellä vuoristoalueilla. Se on rikas kuivuutta kestävien geenien lähde. Kuivuutta kestävien geenien löytäminen on kriittisen tärkeää sinappilajikkeiden parantamisen ja ituplasmaresurssien innovoinnin kannalta. GRF-perheellä on ratkaiseva rooli kasvien kasvussa ja kehityksessä sekä kuivuusstressiin reagoinnissa. Tällä hetkellä GRF-geenejä on löydetty Arabidopsis-lajikkeesta 2, riisistä (Oryza sativa) 12, rypsistä 13, puuvillasta (Gossypium hirsutum) 14, vehnästä (Triticum aestivum) 15, helmihirssistä (Setaria italica) 16 ja Brassica-kasveista 17, mutta GRF-geeneistä ei ole raportteja sinapin kasveissa. Tässä tutkimuksessa sinapin GRF-perheen geenit tunnistettiin koko genomin tasolla ja analysoitiin niiden fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia, evolutiivisia suhteita, homologiaa, säilyneitä motiiveja, geenirakennetta, geeniduplikaatioita, cis-elementtejä ja taimivaihetta (nelilehtinen vaihe). Kuivuusstressin alaisia ilmentymismalleja analysoitiin kattavasti, jotta saatiin tieteellinen perusta jatkotutkimuksille BjGRF-geenien mahdollisesta toiminnasta kuivuusvasteessa ja jotta löydettiin kandidaattigeenejä kuivuutta sietävän sinapin jalostukseen.
Brassica juncea -genomista tunnistettiin 34 BjGRF-geeniä kahdella HMMER-haulla, ja kaikki sisältävät QLQ- ja WRC-domeenit. Tunnistettujen BjGRF-geenien CDS-sekvenssit on esitetty lisätaulukossa S1. BjGRF01–BjGRF34 on nimetty niiden sijainnin kromosomissa perusteella. Tämän perheen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet osoittavat, että aminohappojen pituus vaihtelee suuresti, vaihdellen 261 aminohaposta (BjGRF19) 905 aminohappoon (BjGRF28). BjGRF:n isoelektrinen piste vaihtelee 6,19:stä (BjGRF02) 9,35:een (BjGRF03), keskimäärin 8,33, ja 88,24 % BjGRF:stä on emäksinen proteiini. BjGRF:n ennustettu molekyylipainoalue on 29,82 kDa (BjGRF19) - 102,90 kDa (BjGRF28); BjGRF-proteiinien epävakausindeksi vaihtelee välillä 51,13 (BjGRF08) - 78,24 (BjGRF19), kaikki ovat yli 40, mikä osoittaa, että rasvahappoindeksi vaihtelee välillä 43,65 (BjGRF01) - 78,78 (BjGRF22), keskimääräinen hydrofiilisyys (GRAVY) vaihtelee välillä -1,07 (BjGRF31) - -0,45 (BjGRF22), kaikilla hydrofiilisillä BjGRF-proteiineilla on negatiiviset GRAVY-arvot, mikä voi johtua tähteiden aiheuttamasta hydrofobisuuden puutteesta. Subsellulaarisen lokalisaation ennuste osoitti, että 31 BjGRF:n koodaamaa proteiinia voitiin lokalisoida tumaan, BjGRF04 voitiin lokalisoida peroksisomeihin, BjGRF25 voitiin lokalisoida sytoplasmaan ja BjGRF28 voitiin lokalisoida viherplasteihin (taulukko 1), mikä viittaa siihen, että BjGRF:t voivat lokalisoitua tumaan ja niillä voi olla tärkeä säätelyrooli transkriptiotekijänä.
Eri lajien GRF-perheiden fylogeneettinen analyysi voi auttaa geenien toimintojen tutkimisessa. Siksi ladattiin 35 rypsin, 16 nauriin, 12 riisin, 10 hirssin ja 9 Arabidopsis-kasvin GRF-geenin täyspitkät aminohapposekvenssit ja 34 tunnistetun BjGRF-geenin perusteella rakennettiin fylogeneettinen puu (kuva 1). Kolmella alaperheellä on eri määrä jäseniä; 116 GRF-transkriptiotekijää on jaettu kolmeen eri alaperheeseen (ryhmät A–C), jotka sisältävät vastaavasti 59 (50,86 %), 34 (29,31 %) ja 23 (19,83 %) GRF-geenejä. Näistä 34 BjGRF-perheen jäsentä on hajallaan kolmessa alaperheessä: 13 jäsentä ryhmässä A (38,24 %), 12 jäsentä ryhmässä B (35,29 %) ja 9 jäsentä ryhmässä C (26,47 %). Sinapin polyploidisaatioprosessissa BjGRF-geenien lukumäärä eri alaperheissä vaihtelee, ja geenien monistumista ja häviämistä on saattanut tapahtua. On syytä huomata, että riisin ja hirssin GRF:illä ei ole jakaumaa C-ryhmässä, kun taas B-ryhmässä on kaksi riisin GRF:ää ja yksi hirssin GRF, ja useimmat riisin ja hirssin GRF:t on ryhmitelty yhteen haaraan, mikä osoittaa, että BjGRF:t ovat läheistä sukua kaksisirkkaisille kasveille. Näistä perusteellisimmat tutkimukset GRF:n toiminnasta Arabidopsis thalianassa tarjoavat perustan BjGRF:ien toiminnallisille tutkimuksille.
Sinapin fylogeneettinen puu, johon kuuluvat Brassica napus, Brassica napus, riisi, hirssi ja Arabidopsis thaliana GRF -heimon jäsenet.
Sinappigeenien GRF-perheen toistuvien geenien analyysi. Taustalla oleva harmaa viiva edustaa synkronoitua lohkoa sinappigeenissä, punainen viiva edustaa BjGRF-geenin segmentoituneiden toistojen paria;
BjGRF-geenin ilmentyminen kuivuusstressin aikana neljännen lehden vaiheessa. qRT-PCR-tiedot on esitetty lisätaulukossa S5. Merkittävät erot tiedoissa on merkitty pienillä kirjaimilla.
Ilmaston muuttuessa jatkuvasti viljelykasvien kuivuusstressin sietokyvyn tutkiminen ja niiden sietokykymekanismien parantaminen on noussut kuumaksi tutkimusaiheeksi18. Kuivuuden jälkeen kasvien morfologinen rakenne, geenien ilmentyminen ja aineenvaihduntaprosessit muuttuvat, mikä voi johtaa fotosynteesin loppumiseen ja aineenvaihdunnan häiriöihin ja vaikuttaa sadon satoon ja laatuun19,20,21. Kun kasvit aistivat kuivuussignaaleja, ne tuottavat toisiolähettejä, kuten Ca2+:aa ja fosfatidyyli-inositolia, lisäävät solunsisäistä kalsiumionipitoisuutta ja aktivoivat proteiinien fosforylaatioreitin säätelyverkoston22,23. Lopullinen kohdeproteiini osallistuu suoraan solun puolustukseen tai säätelee siihen liittyvien stressigeenien ilmentymistä transstimulanttien kautta, parantaen kasvien stressinsietokykyä24,25. Siten transstimulanteilla on ratkaiseva rooli kuivuusstressiin reagoinnissa. Kuivuusstressiin reagoivien transstimulanttien sekvenssin ja DNA:han sitoutumisominaisuuksien mukaan transstimulantit voidaan jakaa eri ryhmiin, kuten GRF, ERF, MYB, WRKY ja muihin ryhmiin26.
GRF-geeniperhe on kasvikohtainen transduktiotekijä, jolla on tärkeä rooli useissa eri osa-alueissa, kuten kasvussa, kehityksessä, signaalinsiirrossa ja kasvien puolustusvasteissa27. Ensimmäisen GRF-geenin tunnistamisen jälkeen O. sativassa28 on yhä useampia GRF-geenejä tunnistettu monissa lajeissa ja osoitettu vaikuttavan kasvien kasvuun, kehitykseen ja stressivasteeseen8, 29, 30, 31, 32. Brassica juncean genomisekvenssin julkaisemisen myötä BjGRF-geeniperheen tunnistaminen tuli mahdolliseksi33. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin 34 BjGRF-geeniä koko sinappikasvin genomista ja nimettiin BjGRF01–BjGRF34 niiden kromosomisijainnin perusteella. Kaikissa niissä on erittäin konservoituneita QLQ- ja WRC-domeeneja. Fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien analyysi osoitti, että BjGRF-proteiinien (paitsi BjGRF28) aminohappojen lukumäärän ja molekyylipainon erot eivät olleet merkittäviä, mikä viittaa siihen, että BjGRF-perheen jäsenillä voi olla samanlaisia toimintoja. Geenirakenneanalyysi osoitti, että 64,7 % BjGRF-geeneistä sisälsi 4 eksonia, mikä viittaa siihen, että BjGRF-geenin rakenne on suhteellisen säilynyt evoluutiossa, mutta BjGRF10-, BjGRF16-, BjGRP28- ja BjGRF29-geeneissä eksonien määrä on suurempi. Tutkimukset ovat osoittaneet, että eksonien tai intronien lisääminen tai poistaminen voi johtaa eroihin geenien rakenteessa ja toiminnassa, jolloin syntyy uusia geenejä34,35,36. Siksi oletamme, että BjGRF:n introni on kadonnut evoluution aikana, mikä voi aiheuttaa muutoksia geenien toiminnassa. Yhdenmukaisesti aiempien tutkimusten kanssa havaitsimme myös, että intronien määrä oli yhteydessä geenien ilmentymiseen. Kun intronien määrä geenissä on suuri, geeni voi reagoida nopeasti erilaisiin epäsuotuisiin tekijöihin.
Geenien duplikaatio on merkittävä tekijä genomisessa ja geneettisessä evoluutiossa37. Aiheeseen liittyvät tutkimukset ovat osoittaneet, että geenien duplikaatio ei ainoastaan lisää GRF-geenien määrää, vaan se myös auttaa kasveja sopeutumaan erilaisiin epäsuotuisiin ympäristöolosuhteisiin38. Tässä tutkimuksessa löydettiin yhteensä 48 duplikaattigeeniparia, jotka kaikki olivat segmenttiduplikaatioita, mikä osoittaa, että segmenttiduplikaatiot ovat tärkein mekanismi geenien määrän lisäämiseksi tässä perheessä. Kirjallisuudessa on raportoitu, että segmenttiduplikaatio voi tehokkaasti edistää GRF-geeniperheen jäsenten monistumista Arabidopsis-kasvissa ja mansikoissa, eikä tämän geeniperheen tandemduplikaatiota havaittu missään lajeissa27,39. Tämän tutkimuksen tulokset ovat yhdenmukaisia olemassa olevien Arabidopsis thaliana- ja mansikkaperheitä koskevien tutkimusten kanssa, mikä viittaa siihen, että GRF-perhe voi lisätä geenien määrää ja tuottaa uusia geenejä segmenttiduplikaation kautta eri kasveissa.
Tässä tutkimuksessa sinapista tunnistettiin yhteensä 34 BjGRF-geeniä, jotka jaettiin kolmeen alaryhmään. Näillä geeneillä oli samankaltaisia konservoituneita motiiveja ja geenirakenteita. Kollineaarisuusanalyysi paljasti sinapissa 48 paria segmenttien duplikaatioita. BjGRF-promoottorialue sisältää cis-vaikuttavia elementtejä, jotka liittyvät valovasteeseen, hormonaaliseen vasteeseen, ympäristöstressivasteeseen sekä kasvuun ja kehitykseen. Sinapin taimivaiheessa (juuret, varret, lehdet) havaittiin 34 BjGRF-geenin ilmentymistä, ja 10 BjGRF-geenin ilmentymiskuvio kuivuusolosuhteissa havaittiin. Havaittiin, että BjGRF-geenien ilmentymiskuviot kuivuusstressin aikana olivat samankaltaisia ja saattavat olla samankaltaisia. BjGRF03- ja BjGRF32-geenit saattavat toimia positiivisina säätelyrooleina kuivuusstressissä, kun taas BjGRF06 ja BjGRF23 toimivat kuivuusstressissä miR396-kohdegeeneinä. Kaiken kaikkiaan tutkimuksemme tarjoaa biologisen perustan BjGRF-geenin toiminnan selvittämiselle Brassicaceae-kasveissa tulevaisuudessa.
Tässä kokeessa käytetyt sinapinsiemenet toimitti Guizhoun öljysiementen tutkimuslaitos, Guizhoun maataloustieteiden akatemia. Valitse kokonaiset siemenet ja kylvä ne maaperään (kasvualusta:maa = 3:1) ja kerää juuret, varret ja lehdet neljän lehden vaiheen jälkeen. Kasveja käsiteltiin 20-prosenttisella PEG 6000:lla kuivuuden simuloimiseksi, ja lehdet kerättiin 0, 3, 6, 12 ja 24 tunnin kuluttua. Kaikki kasvinäytteet pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin sitten -80 °C:n pakastimessa seuraavaa testiä varten.
Kaikki tässä tutkimuksessa saadut tai analysoidut tiedot sisältyvät julkaistuun artikkeliin ja lisätiedostoihin.
Julkaisun aika: 22. tammikuuta 2025