Kasvi- ja taudinaiheuttajamateriaalit
Durra-assosiaatiokartoituspopulaation, joka tunnetaan nimellä durra-konversiopopulaatio (SCP), toimitti Dr. Pat Brown Illinoisin yliopistosta (nykyään UC Davisissa). Se on kuvattu aiemmin, ja se on kokoelma erilaisia linjoja, jotka on muunnettu valojaksolle epäherkiksi ja lyhyemmiksi kasvien kasvun ja kehityksen helpottamiseksi Yhdysvaltain ympäristössä. Tässä tutkimuksessa käytettiin tästä populaatiosta 510 linjaa, vaikka huonon itävyyden ja muiden laadunvalvontaongelmien vuoksi kaikkia linjoja ei käytetty kaikkien kolmen ominaisuuden analysoinnissa. Lopulta 345 linjan tietoja käytettiin kitiinivasteen analysointiin, 472 linjan tietoja flg22-vasteen analysointiin ja 456 linjan tietoja TLS-resistenssin analysointiin.B. cookeiLSLP18-kanta saatiin tohtori Burt Bluhmilta Arkansasin yliopistosta.
MAMP-vasteen mittaus
Tässä tutkimuksessa käytettiin kahta eri MAMPia: flg22:ta (Genscript-luettelonumero RP19986) ja kitiiniä. Durrakasveja kasvatettiin kasvihuoneessa mullalla (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) täytettyjen tasojen päällä olevissa istukkaissa. Kasveja kasteltiin näytteenottoa edeltävänä päivänä, jotta vältettäisiin ylimääräinen lehtikosteus keräyspäivänä.
Linjat satunnaistettiin ja logistisista syistä istutettiin 60 linjan erissä. Jokaista linjaa kohden istutettiin kolme "ruukkua", joissa oli kaksi siementä linjaa kohden. Seuraavat erät istutettiin heti, kun edellinen erä oli käsitelty, kunnes koko populaatio oli arvioitu. Molemmille MAMP-genotyypeille tehtiin kaksi koeajoa, joissa genotyypit satunnaistettiin uudelleen kummassakin ajossa.
ROS-määritykset tehtiin aiemmin kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna jokaisesta linjasta istutettiin kuusi siementä kolmeen eri ruukkuun. Tuloksena olevista taimista valittiin kolme tasalaatuisuuden perusteella. Taimia, jotka näyttivät epätavallisilta tai olivat merkittävästi enemmistöä korkeampia tai lyhyempiä, ei käytetty. Kolmen eri 15 päivän ikäisen durrakasvin neljännen lehden leveimmästä osasta leikattiin neljä halkaisijaltaan 3 mm:n lehtikiekkoa. Yksi kiekko lehteä kohden kahdesta kasvista ja kaksi kiekkoa yhdestä kasvista, toisen kiekon toimiessa vesikontrollina (katso alla). Kiekot kellutettiin yksi kerrallaan 50 µl:n H20:n päällä mustalla 96-kuoppalevyllä, joka suljettiin alumiinisinetillä valolta suojamiseksi ja pidettiin huoneenlämmössä yön yli. Seuraavana aamuna reaktioliuos valmistettiin käyttämällä 2 mg/ml kemiluminesenssi-koetinta L-012 (Wako, luettelonumero 120-04891), 2 mg/ml piparjuuriperoksidaasia (tyyppi VI-A, Sigma-Aldrich, luettelonumero P6782) ja 100 mg/ml kitiiniä tai 2 μM Flg22:ta. Tätä reaktioliuosta lisättiin 50 µl kolmeen neljästä kuopasta. Neljäs kuoppa oli kontrollikuoppa, johon lisättiin reaktioliuosta ilman MAMP:ia. Jokaisella levyllä oli myös neljä nollakuoppaa, jotka sisälsivät vain vettä.
Reaktioliuoksen lisäämisen jälkeen luminesenssi mitattiin SynergyTM 2 -monimittauslevylukijalla (BioTek) kahden minuutin välein tunnin ajan. Levynlukija ottaa luminesenssimittauksia kahden minuutin välein tämän tunnin aikana. Kaikkien 31 lukeman summa laskettiin kunkin kuopan arvon saamiseksi. Kunkin genotyypin MAMP-vasteen arvioitu arvo laskettiin seuraavasti: (kolmen kokeellisen kuopan keskimääräinen luminesenssiarvo – mallikuopan arvo) - vähennettynä tyhjän kuopan keskiarvolla. Tyhjän kuopan arvot olivat jatkuvasti lähellä nollaa.
LehtilevyjäNicotiana benthamianaLaadunvalvontatarkoituksiin jokaiselle 96-kuoppalevylle sisällytettiin myös yksi korkeaherkkä durralinja (SC0003) ja yksi matalaherkkä durralinja (PI 6069) kontrolliksi.
B. cookeiinokulaatin valmistus ja inokulaatio
B. cookeiInokulaatti valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna durranjyviä liotettiin vedessä kolme päivää, huuhdeltiin, kauhottiin 1 litran erlenmeyerpulloihin ja autoklavoitiin tunnin ajan 15 psi:n paineessa ja 121 °C:n lämpötilassa. Jyvät inokuloitiin sitten noin 5 ml:lla tuoreesta viljelmästä peräisin olevaa maseroitua rihmastoa.B. cookeiLSLP18-isolaatit ja jätettiin kahden viikon ajaksi huoneenlämpöön ravistaen pulloja kolmen päivän välein. Kahden viikon kuluttua sienen saastuttamat durranjyvät ilmakuivattiin ja säilytettiin sitten 4 °C:ssa, kunnes ne inokuloitiin kenttään. Samaa inokulaattia käytettiin koko kokeen ajan ja se tehtiin tuoreena joka vuosi. Inokulaatiota varten 6–10 saastunutta jyvää laitettiin 4–5 viikon ikäisten durrakasvien kiehkuraan. Näistä sienistä tuotetut itiöt käynnistivät infektion nuorissa durrakasveissa viikon kuluessa.
Siementen valmistelu
Ennen pellolle kylvöä durran siemenet käsiteltiin sienitautien torjunta-aineen, hyönteisten torjunta-aineen ja kasvinsuojeluaineen seoksella, joka sisälsi ~1 % Spirato 480 FS -sienitautien torjunta-ainetta, 4 % Sebring 480 FS -sienitautien torjunta-ainetta ja 3 % Sorpro 940 ES -siementen suoja-ainetta. Sen jälkeen siemeniä ilmakuivattiin 3 päivää, jolloin niiden ympärille muodostui ohut seoskerros. Kasvinsuojeluaine mahdollisti Dual Magnumin käytön rikkakasvien torjunta-aineena ennen itämistä.
Kohdelehtilaikkujen vastustuskyvyn arviointi
SCP-kasvit istutettiin Central Crops Research Stationilla Claytonissa, Pohjois-Carolinassa, 14.–15. kesäkuuta 2017 ja 20. kesäkuuta 2018 satunnaistetulla täydellisen lohkon asetelmalla, jossa oli kaksi kokeellista toistoa kummassakin tapauksessa. Kokeet istutettiin 1,8 metrin yksittäisiin riveihin 0,9 metrin rivivälillä käyttäen 10 siementä koealaa kohden. Kunkin kokeen reunoille istutettiin kaksi reunariviä reunavaikutusten estämiseksi. Kokeet inokuloitiin 20. heinäkuuta 2017 ja 20. heinäkuuta 2018, jolloin durrakasvit olivat kasvuvaiheessa 3. Arviointi tehtiin asteikolla yhdestä yhdeksään, jossa kasvit, joilla ei ollut taudin merkkejä, pisteytettiin yhdeksällä ja täysin kuolleet kasvit pisteytettiin yhdellä. Vuonna 2017 tehtiin kaksi arviota ja vuonna 2018 neljä mittausta alkaen kaksi viikkoa inokulaation jälkeen kunakin vuonna. sAUDPC (standardoitu taudin etenemiskäyrän alla oleva pinta-ala) laskettiin aiemmin kuvatulla tavalla.
Julkaisun aika: 1. huhtikuuta 2021