Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan tuloksen saavuttamiseksi suosittelemme, että käytät uudempaa selainversiota (tai poistat yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylittelyä tai JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Sienitautien torjunta-aineita käytetään usein puiden hedelmien kukinnan aikana, ja ne voivat uhata hyönteispölyttäjiä. Kuitenkin tiedetään vähän siitä, miten muut kuin mehiläispölyttäjät (esim. erakkomehiläiset, Osmia cornifrons) reagoivat kosketus- ja systeemisiin sienitautien torjunta-aineisiin, joita yleisesti käytetään omenoilla kukinnan aikana. Tämä tietämysvaje rajoittaa sääntelyyn liittyviä päätöksiä, jotka määrittävät turvallisia pitoisuuksia ja sienitautien torjunta-aineiden ruiskutuksen ajoitusta. Arvioimme kahden kosketussienitautien torjunta-aineen (kaptaani ja mankotsebi) ja neljän välikerros-/fytosysteemisienitautien torjunta-aineen (siprosykliini, myklobutaniili, pyrostrobiini ja trifloksistrobiini) vaikutuksia. Vaikutukset toukkien painonnousuun, eloonjäämiseen, sukupuolisuhteeseen ja bakteerien monimuotoisuuteen. Arviointi suoritettiin käyttämällä kroonista oraalista biomääritystä, jossa siitepölyä käsiteltiin kolmella annoksella, jotka perustuivat nykyiseen peltokäyttöön suositeltuun annokseen (1X), puoleen annokseen (0,5X) ja pieneen annokseen (0,1X). Kaikki mankotsebi- ja pyritisoliiniannokset vähensivät merkittävästi ruumiinpainoa ja toukkien eloonjäämistä. Sitten sekvensoimme 16S-geenin karakterisoidaksemme mankotsebin, korkeimman kuolleisuuden aiheuttavan sienitautien torjunta-aineen, toukkien bakteriomia. Havaitsimme, että mankotsebilla käsiteltyä siitepölyä syöneiden toukkien bakteerien monimuotoisuus ja runsaus vähenivät merkittävästi. Laboratoriotuloksemme osoittavat, että joidenkin näiden sienitautien torjunta-aineiden ruiskuttaminen kukinnan aikana on erityisen haitallista O. cornifronsin terveydelle. Nämä tiedot ovat merkityksellisiä tuleville hoitopäätöksille hedelmäpuiden suojeluaineiden kestävästä käytöstä ja toimivat perustana pölyttäjien suojelemiseen tähtääville sääntelyprosesseille.
Erakkomehiläinen Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) tuotiin Yhdysvaltoihin Japanista 1970-luvun lopulla ja 1980-luvun alussa, ja lajilla on siitä lähtien ollut tärkeä pölyttäjä rooli hoidetuissa ekosysteemeissä. Tämän mehiläisen naturalisoituneet populaatiot ovat osa noin 50 villimehiläislajia, jotka täydentävät Yhdysvaltojen manteli- ja omenatarhoja pölyttäviä mehiläisiä2,3. Muurarimehiläiset kohtaavat monia haasteita, kuten elinympäristön pirstaloitumisen, taudinaiheuttajat ja torjunta-aineet3,4. Hyönteismyrkkyistä sienitautien torjunta-aineet vähentävät energian saantia, ravinnon etsintää5 ja kehon kunnostamista6,7. Vaikka viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että kommensaaliset ja ektobakteeriset mikro-organismit vaikuttavat suoraan muurarimehiläisten terveyteen8,9 koska bakteerit ja sienet voivat vaikuttaa ravitsemukseen ja immuunivasteisiin, sienitautien torjunta-aineille altistumisen vaikutuksia muurarimehiläisten mikrobien monimuotoisuuteen aletaan vasta tutkia.
Erilaisia vaikutuksia omaavia (kosketus- ja systeemisiä) sienitautien torjunta-aineita ruiskutetaan hedelmätarhoissa ennen kukintaa ja sen aikana sellaisten tautien kuin omenarupen, karvaan mädän, ruskomädän ja härmän10,11 hoitamiseksi. Sienitautien torjunta-aineita pidetään pölyttäjille vaarattomina, joten niitä suositellaan puutarhureille kukinta-aikana. Mehiläisten altistuminen näille sienitautien torjunta-aineille ja niiden nauttiminen on suhteellisen hyvin tiedossa, koska se on osa Yhdysvaltain ympäristönsuojeluviraston ja monien muiden kansallisten sääntelyvirastojen torjunta-aineiden rekisteröintiprosessia12,13,14. Sienitautien torjunta-aineiden vaikutukset muihin kuin mehiläisiin ovat kuitenkin vähemmän tunnettuja, koska niitä ei vaadita myyntilupasopimuksissa Yhdysvalloissa15. Lisäksi yksittäisten mehiläisten testaamiseen ei yleensä ole standardoituja protokollia16,17, ja testausmehiläisiä tarjoavien yhdyskuntien ylläpitäminen on haastavaa18. Euroopassa ja Yhdysvalloissa tehdään yhä enemmän kokeita eri hoidetuilla mehiläisillä torjunta-aineiden vaikutusten tutkimiseksi villimehiläisiin, ja standardoituja protokollia on äskettäin kehitetty O. cornifronsille19.
Sarvimehiläiset ovat monosyyttejä, ja niitä käytetään kaupallisesti karppikasveissa hunajamehiläisten täydennyksenä tai korvikkeena. Nämä mehiläiset kuoriutuvat maalis-huhtikuun välisenä aikana, ja varhaiskypsät koiraat kuoriutuvat kolme tai neljä päivää ennen naaraita. Parittelun jälkeen naaras kerää aktiivisesti siitepölyä ja mettä tarjotakseen sarjan sikiösoluja putkimaiseen pesänonteloon (luonnolliseen tai keinotekoiseen)1,20. Munat munivat siitepölyn päälle solujen sisällä; naaras rakentaa sitten saviseinän ennen seuraavan solun valmistelua. Ensimmäisen vaiheen toukat sulkeutuvat suonikalvoon ja syövät alkionestettä. Toisesta viidenteen vaiheeseen (esikoe) toukat syövät siitepölyä22. Kun siitepölyvarastot ovat kokonaan loppuneet, toukat muodostavat koteloita, koteloituvat ja kuoriutuvat aikuisina samaan sikiökammioon, yleensä loppukesällä20,23. Aikuiset kuoriutuvat seuraavana keväänä. Aikuisten eloonjääminen liittyy nettoenergianlisääntymiseen (painonnousuun), joka perustuu ravinnon saantiin. Siten siitepölyn ravintoarvo sekä muut tekijät, kuten sää tai altistuminen torjunta-aineille, ovat selviytymisen ja terveyden määrääviä tekijöitä24.
Ennen kukintaa levitetyt hyönteis- ja sienitautien torjunta-aineet pystyvät liikkumaan kasvin verisuonistossa vaihtelevassa määrin, translaminaarisista (esim. kykenevät siirtymään lehtien yläpinnalta alapinnalle, kuten jotkut sienitautien torjunta-aineet)25 todella systeemisiin vaikutuksiin. , jotka voivat tunkeutua latvukseen juurista, voivat päästä omenankukkien meteen26, jossa ne voivat tappaa aikuisia O. cornifrons -sieniä27. Jotkut torjunta-aineet huuhtoutuvat myös siitepölyyn, mikä vaikuttaa maissintoukkien kehitykseen ja aiheuttaa niiden kuoleman19. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut sienitautien torjunta-aineet voivat muuttaa merkittävästi sukulaislajin O. lignaria pesimäkäyttäytymistä28. Lisäksi laboratorio- ja kenttätutkimukset, joissa simuloidaan torjunta-ainealtistusskenaarioita (mukaan lukien sienitautien torjunta-aineet), ovat osoittaneet, että torjunta-aineet vaikuttavat negatiivisesti hunajamehiläisten ja joidenkin erakkomehiläisten fysiologiaan22, morfologiaan29 ja selviytymiseen. Erilaiset sienitautien torjunta-aineet, joita levitetään suoraan avoimiin kukkiin kukinnan aikana, voivat saastuttaa aikuisten toukkien kehitystä varten keräämää siitepölyä, jonka vaikutuksia on vielä tutkittava30.
Yhä useammin tunnustetaan, että ruoansulatusjärjestelmän siitepöly ja mikrobiyhteisöt vaikuttavat toukkien kehitykseen. Mehiläisen mikrobiomi vaikuttaa parametreihin, kuten ruumiinmassaan31, aineenvaihdunnan muutoksiin22 ja alttiuteen taudinaiheuttajille32. Aiemmissa tutkimuksissa on tutkittu kehitysvaiheen, ravinteiden ja ympäristön vaikutusta yksin elävien mehiläisten mikrobiomiin. Nämä tutkimukset paljastivat yhtäläisyyksiä toukkien ja siitepölymikrobiomien rakenteessa ja runsaudessa33 sekä yleisimpien bakteerisukujen Pseudomonas ja Delftia joukossa yksin elävien mehiläisten lajien keskuudessa. Vaikka sienitautien torjunta-aineita on yhdistetty mehiläisten terveyden suojelemiseen tähtääviin strategioihin, sienitautien torjunta-aineiden vaikutuksia toukkien mikrobiotaan suoran oraalisen altistuksen kautta on kuitenkin edelleen tutkimatta.
Tässä tutkimuksessa testattiin kuuden yleisesti käytetyn, puiden hedelmiin Yhdysvalloissa rekisteröidyn sienitautien torjunta-aineen todellisia annoksia. Näihin annoksiin kuuluivat kontakti- ja systeemiset sienitautien torjunta-aineet, joita annettiin suun kautta maissintähkän toukille saastuneesta ruoasta. Havaitsimme, että kontakti- ja systeemiset sienitautien torjunta-aineet vähensivät mehiläisten painonnousua ja lisäsivät kuolleisuutta, ja vakavimmat vaikutukset liittyivät mankotsebiin ja pyritiopidiin. Sitten vertasimme mankotsebilla käsitellyllä siitepölyravinnolla ruokittujen toukkien mikrobien monimuotoisuutta kontrolliravinnolla ruokittujen toukkien mikrobien monimuotoisuuteen. Keskustelemme kuolleisuuden taustalla olevista mahdollisista mekanismeista ja niiden vaikutuksista integroituun tuholais- ja pölyttäjien torjuntaan (IPPM)36.
Aikuiset koteloissa talvehtivat O. cornifrons -pesäkkeen kotelot hankittiin Fruit Research Centeristä Biglervillestä, Pennsylvaniasta, ja niitä säilytettiin −3–2 °C:ssa (±0,3 °C). Ennen koetta (yhteensä 600 koteloa). Toukokuussa 2022 100 O. cornifrons -pesäkkeen koteloa siirrettiin päivittäin muovikuppeihin (50 koteloa kuppia kohden, DI 5 cm × 15 cm pitkä), ja kuppien sisään asetettiin pyyhkeitä avautumisen edistämiseksi ja pureskeltavan substraatin tarjoamiseksi, mikä vähensi kivimehiläisten stressiä37. Aseta kaksi koteloita sisältävää muovikuppia hyönteishäkkiin (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Taiwan) 10 ml:n syöttölaitteilla, jotka sisältävät 50-prosenttista sakkaroosiliuosta, ja säilytä neljä päivää sulkeutumisen ja parittelun varmistamiseksi. 23 °C, suhteellinen kosteus 60 %, valojakso 10 l (alhainen intensiteetti): 14 päivää. 100 pariteltua naarasta ja urosta vapautettiin joka aamu kuuden päivän ajan (100 päivässä) kahteen keinotekoiseen pesään omenapuiden kukinnan huippuvaiheessa (ansapesä: leveys 33,66 × korkeus 30,48 × pituus 46,99 cm; lisäkuva 1). Sijoitettu Pennsylvanian osavaltion arboretumiin lähelle kirsikkaa (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), persikkaa (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), päärynää (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), omenapuuta (Malus coronaria) ja lukuisia omenapuulajikkeita (Malus coronaria, Malus), kotimaista omenapuuta 'Co-op 30′ Enterprise™, Malus apple tree 'Co-Op 31′ Winecrisp™, begoniaa 'Freedom', Begonia 'Golden Delicious', Begonia 'Nova Spy'). Jokainen sininen muovinen linnunpönttö mahtuu kahden puulaatikon päälle. Jokainen pesäpönttö sisälsi 800 tyhjää voimapaperiputkea (spiraalimaisesti auki, sisähalkaisija 0,8 cm × pituus 15 cm) (Jonesville Paper Tube Co., Michigan), jotka oli työnnetty läpinäkymättömiin sellofaaniputkiin (ulkohalkaisija 0,7 cm, katso ). Muovitulpat (T-1X-tulpat) toimivat pesimäpaikoina.
Molemmat pesäpöntöt olivat itään päin ja ne oli peitetty vihreällä muovisella puutarha-aidalla (Everbilt-malli #889250EB12, aukon koko 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m) jyrsijöiden ja lintujen pääsyn estämiseksi. Aidat sijoitettiin maan pinnalle pesäpöntön multalaatikoiden viereen. Pesäpönttö (lisäkuva 1a). Maissikoisan munia kerättiin päivittäin keräämällä 30 putkea pesistä ja kuljettamalla ne laboratorioon. Tee saksilla putken päähän leikkaus ja pura sitten spiraalimainen putki sikiösolujen paljastamiseksi. Yksittäiset munat ja niiden siitepöly poistettiin kaarevalla lastalla (Microslide-työkalusarja, BioQuip Products Inc., Kalifornia). Munat inkuboitiin kostealla suodatinpaperilla ja asetettiin petrimaljaan kahdeksi tunniksi ennen kuin niitä käytettiin kokeissamme (lisäkuva 1b-d).
Laboratoriossa arvioimme kuuden sienitautien torjunta-aineen oraalista myrkyllisyyttä. Näitä torjunta-aineita levitettiin ennen omenankukkaa ja sen aikana kolmella pitoisuudella (0,1X, 0,5X ja 1X, jossa 1X on levitetty merkki 100 gallonaa vettä/eekkeri. Suuri peltoannos = pitoisuus pellolla). , taulukko 1). Jokainen pitoisuus toistettiin 16 kertaa (n = 16). Kaksi kontaktifungisidien (taulukko S1: mankotsebi 2696,14 ppm ja kaptaani 2875,88 ppm) ja neljä systeemistä fungisidien (taulukko S1: pyritiostrobiini 250,14 ppm; trifloksistrobiini 110,06 ppm; myklobutaniiliatsoli 75,12 ppm; syprodiniili 280,845 ppm) havaitsivat myrkyllisyyden hedelmille, vihanneksille ja koristekasveille. Homogenisoimme siitepölyn jauhimella, siirsimme 0,20 g kuoppaan (24-kuoppainen Falcon-levy) ja lisäsimme ja sekoitimme 1 μl sienitautien torjunta-aineliuosta muodostaen pyramidimaisen siitepölyn, jossa oli 1 mm syvät kuopat, joihin munat asetettiin. Aseta mini-lastalla (lisäkuva 1c, d). Falcon-levyt säilytettiin huoneenlämmössä (25 °C) ja 70 %:n suhteellisessa kosteudessa. Vertailimme niitä kontrollitoukkiin, joille syötettiin homogeenista siitepölyravinnetta, jota oli käsitelty puhtaalla vedellä. Kirjasimme kuolleisuuden ja mittasimme toukkien painon joka toinen päivä, kunnes toukat saavuttivat koteloitumisiän, käyttämällä analyysivaakaa (Fisher Scientific, tarkkuus = 0,0001 g). Lopuksi sukupuolisuhde arvioitiin avaamalla kotelo 2,5 kuukauden kuluttua.
DNA eristettiin kokonaisista O. cornifrons -toukista (n = 3 käsittelyolosuhdetta kohden, mankotsebilla käsitelty ja käsittelemätön siitepöly) ja suoritimme näille näytteille mikrobien monimuotoisuusanalyysit, erityisesti siksi, että mankotsebissa kuolleisuus havaittiin korkein MnZn:ää saaneilla toukilla. DNA monistettiin, puhdistettiin DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA -kitillä (Zymo Research, Irvine, CA) ja sekvensoitiin (600 sykliä) Illumina® MiSeq™ -laitteella käyttäen v3-kittiä. Bakteerien 16S-ribosomaalisten RNA-geenien kohdennettu sekvensointi suoritettiin käyttämällä Quick-16S™ NGS Library Prep Kit -kittiä (Zymo Research, Irvine, CA) käyttäen alukkeita, jotka kohdistuivat 16S rRNA -geenin V3-V4-alueelle. Lisäksi 18S-sekvensointi suoritettiin käyttämällä 10 % PhiX-inkluusiota, ja monistus suoritettiin käyttämällä alukeparia 18S001 ja NS4.
Tuo ja käsittele paritetut lukemat39 QIIME2-prosessilla (v2022.11.1). Nämä lukemat leikattiin ja yhdistettiin, ja kimeeriset sekvenssit poistettiin käyttämällä DADA2-laajennusta QIIME2:ssa (qiime dada2 noise pairing)40. 16S- ja 18S-luokkien määritys suoritettiin käyttämällä objektiluokittelijalaajennusta Classify-sklearn ja esikoulutettua artefaktia silva-138-99-nb-classifier.
Kaikki kokeelliset tiedot tarkistettiin varianssien normaaliuden (Shapiro-Wilks) ja varianssien homogeenisuuden (Levenen testi) suhteen. Koska aineisto ei täyttänyt parametrisen analyysin oletuksia eikä muunnos standardoinut residuaaleja, suoritimme ei-parametrisen kaksisuuntaisen ANOVA:n (Kruskal-Wallis) kahdella tekijällä [aika (kolmivaiheinen 2, 5 ja 8 päivän aikapisteet) ja sienitautien torjunta-aine] arvioidaksemme käsittelyn vaikutusta toukkien tuorepainoon. Tämän jälkeen suoritettiin post hoc ei-parametriset parittaiset vertailut Wilcoxonin testiä käyttäen. Käytimme yleistettyä lineaarista mallia (GLM) Poisson-jakaumalla verrataksemme sienitautien torjunta-aineiden vaikutuksia eloonjäämiseen kolmella sienitautien torjunta-ainepitoisuudella41,42. Differentiaalista runsausanalyysiä varten amplikonisekvenssivarianttien (ASV) lukumäärä supistettiin suvutasolla. Ryhmien välisten differentiaalisten runsauksien vertailut käyttäen 16S:ää (sukutaso) ja 18S:n suhteellista runsautta tehtiin käyttämällä yleistettyä additiivista mallia sijainnille, mittakaavalle ja muodolle (GAMLSS) ja beeta-nollainflatoituja (BEZI) perhejakaumia, jotka mallinnettiin makrolla Microbiome R43:ssa (v1.1). 1). Poista mitokondrio- ja viherhiukkaslajit ennen differentiaalianalyysiä. Koska 18S:llä on eri taksonomisia tasoja, differentiaalianalyyseissä käytettiin vain kunkin taksonin alinta tasoa. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin R:llä (v. 3.4.3., CRAN-projekti) (Team 2013).
Mankotsebille, pyritiostrobiinille ja trifloksistrobiinille altistuminen vähensi merkittävästi O. cornifronsin painonnousua (kuva 1). Näitä vaikutuksia havaittiin johdonmukaisesti kaikilla kolmella arvioidulla annoksella (kuva 1a–c). Syklostrobiini ja myklobutaniili eivät vähentäneet merkittävästi toukkien painoa.
Varsiporakoiran toukkien keskimääräinen tuorepaino mitattuna kolmena ajankohtana neljällä ruokavaliokäsittelyllä (homogeeninen siitepölyravinne + sienitautien torjunta-aine: kontrolli, annokset 0,1X, 0,5X ja 1X). (a) Pieni annos (0,1X): ensimmäinen ajankohta (päivä 1): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, toinen ajankohta (päivä 5): 22,83, DF = 0,0009; kolmas kerta; ajankohta (päivä 8): χ2: 28,39, DF = 6; (b) puolikas annos (0,5X): ensimmäinen ajankohta (päivä 1): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, toinen ajankohta (päivä yksi). ): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; kolmas ajankohta (päivä 8) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Pistoskohta tai täysi annos (1X): ensimmäinen ajankohta (päivä 1) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, toinen ajankohta (päivä 5): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; kolmas ajankohta (päivä 8): χ2: 28,39, DF = 6; ei-parametrinen varianssianalyysi. Pylväät edustavat parittaisten vertailujen keskiarvoa ± SE (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Pienimmällä annoksella (0,1X) toukkien paino laski 60 % trifloksistrobiinilla, 49 % mankotsebilla, 48 % myklobutaniililla ja 46 % pyritistrobiinilla (kuva 1a). Kun mankotsebin toukat altistettiin puolelle kenttäannoksesta (0,5X), niiden paino laski 86 %, pyritiostrobiinilla 52 % ja trifloksistrobiinilla 50 % (kuva 1b). Täysi kenttäannos (1X) mankotsebia vähensi toukkien painoa 82 %, pyritiostrobiinilla 70 % ja trifloksistrobiinilla, myklobutaniililla ja sangardilla noin 30 % (kuva 1c).
Kuolleisuus oli suurin mankotsebilla käsitellyllä siitepölyllä ruokituilla toukilla, seuraavaksi korkein pyritiostrobiinilla ja trifloksistrobiinilla. Kuolleisuus lisääntyi mankotsebin ja pyritisoliiniannosten kasvaessa (kuva 2; taulukko 2). Maissikoisan kuolleisuus lisääntyi kuitenkin vain hieman trifloksistrobiinipitoisuuksien kasvaessa; syprodiniili ja kaptaani eivät lisänneet kuolleisuutta merkittävästi kontrollihoitoihin verrattuna.
Maissintoukkien kuolleisuutta verrattiin siitepölyn nauttimisen jälkeen, kun niitä oli käsitelty erikseen kuudella eri sienitautien torjunta-aineella. Mankotsebi ja pentopyramidi olivat herkempiä maissintähkien oraaliselle altistukselle (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (viiva, kulmakerroin = 0,29, P < 0,001; kulmakerroin = 0,24, P < 0,00)).
Kaikissa hoidoissa keskimäärin 39,05 % potilaista oli naisia ja 60,95 % miehiä. Kontrolliryhmässä naisten osuus oli 40 % sekä pienen annoksen (0,1X) että puolen annoksen (0,5X) tutkimuksissa ja 30 % kenttäannoksen (1X) tutkimuksissa. 0,1-kertaisella annoksella siitepölyllä ruokituista mankotsebilla ja myklobutaniililla hoidetuista toukista 33,33 % oli naaraita, 22 % aikuisista oli naaraita, 44 % aikuisista toukista oli naaraita ja 44 % aikuisista toukista oli naaraita. 41 % aikuisista toukista oli naaraita ja kontrolliryhmässä oli 31 % (kuva 3a). 0,5-kertaisella annoksella 33 % mankotsebi- ja pyritiostrobiiniryhmän aikuisista madoista oli naaraita, 36 % trifloksistrobiiniryhmässä, 41 % myklobutaniiliryhmässä ja 46 % syprostrobiiniryhmässä. Tämä luku oli 53 % kaptaaniryhmässä ja 38 % kontrolliryhmässä (kuva 3b). Yhdenkertaisella annoksella 30 % mankotsebiryhmästä oli naisia, 36 % pyritiostrobiiniryhmästä, 44 % trifloksistrobiiniryhmästä, 38 % myklobutaniiliryhmästä ja 50 % kontrolliryhmästä – 38,5 % (kuva 3c).
Naaras- ja koirasporojen prosenttiosuus toukkavaiheen sienitautien torjunta-aineelle altistumisen jälkeen. (a) Pieni annos (0,1X). (b) Puolikas annos (0,5X). c) Kenttäannos tai täysi annos (1X).
16S-sekvenssianalyysi osoitti, että bakteeriryhmä erosi mankotsebilla käsiteltyä siitepölyä saaneiden toukkien ja käsittelemätöntä siitepölyä saaneiden toukkien välillä (kuva 4a). Käsittelemättömien, siitepölyä saaneiden toukkien mikrobisto oli korkeampi kuin mankotsebilla käsiteltyä siitepölyä saaneiden toukkien mikrobisto (kuva 4b). Vaikka havaittu ero ryhmien välillä rikkaudessa ei ollut tilastollisesti merkitsevä, se oli merkittävästi pienempi kuin käsittelemätöntä siitepölyä saaneiden toukkien mikrobisto (kuva 4c). Suhteellinen runsaus osoitti, että kontrollisiitepölyä saaneiden toukkien mikrobisto oli monimuotoisempi kuin mankotsebilla käsiteltyjä toukkia saaneiden toukkien mikrobisto (kuva 5a). Deskriptiivinen analyysi paljasti 28 suvun esiintymisen kontrolli- ja mankotsebilla käsitellyissä näytteissä (kuva 5b). c 18S-sekvensointia käyttävä analyysi ei paljastanut merkittäviä eroja (lisäkuva 2).
16S-sekvensseihin perustuvia SAV-profiileja verrattiin Shannonin rikkauteen ja pääjaksotasolla havaittuun rikkauteen. (a) Pääkoordinaattianalyysi (PCoA) perustui kokonaismikrobiyhteisön rakenteeseen käsittelemättömällä siitepölyllä ruokituilla tai kontrollilla (sininen) ja mankotsebilla ruokituilla toukilla (oranssi). Jokainen datapiste edustaa erillistä näytettä. PCoA laskettiin käyttämällä monimuuttuja-t-jakauman Bray-Curtisin etäisyyttä. Soikiot edustavat 80 %:n luottamustasoa. (b) Laatikkodiagrammi, raaka Shannonin rikkausdata (pisteet) ja c. Havaittava rikkaus. Laatikkodiagrammit näyttävät laatikot mediaaniviivalle, kvartiilivälille (IQR) ja 1,5 × IQR:lle (n = 3).
Mankotsebilla käsitellyllä ja käsittelemättömällä siitepölyllä ruokittujen toukkien mikrobiyhteisöjen koostumus. (a) Mikrobisukujen suhteellinen runsaus toukissa. (b) Tunnistettujen mikrobiyhteisöjen lämpökartta. Delftia (riskisuhde (OR) = 0,67, P = 0,0030) ja Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); Lämpökartan rivit on ryhmitelty korrelaatioetäisyyden ja keskimääräisen kytkeytyneisyyden avulla.
Tuloksemme osoittavat, että altistuminen kontakti- (mankotsebi) ja systeemisille (pyrostrobiini ja trifloksistrobiini) sienitautien torjunta-aineille, joita käytettiin laajalti kukinnan aikana, vähensi merkittävästi maissintoukkien painonnousua ja lisäsi kuolleisuutta. Lisäksi mankotsebi vähensi merkittävästi mikrobiomin monimuotoisuutta ja rikkautta koteloitumisvaiheessa. Myklobutaniili, toinen systeeminen sienitautien torjunta-aine, vähensi merkittävästi toukkien painonnousua kaikilla kolmella annoksella. Tämä vaikutus oli havaittavissa toisena (päivä 5) ja kolmantena (päivä 8) mittausajankohtana. Sitä vastoin syprodiniili ja kaptaani eivät vähentäneet merkittävästi painonnousua tai eloonjäämistä verrattuna kontrolliryhmään. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen, jossa määritetään eri sienitautien torjunta-aineiden kenttäannosten vaikutuksia, joita käytetään maissikasvustojen suojaamiseen suoran siitepölyaltistuksen kautta.
Kaikki sienitautien torjunta-ainekäsittelyt vähensivät merkittävästi painonnousua verrattuna kontrollikäsittelyihin. Mankotsebilla oli suurin vaikutus toukkien painonnousuun, keskimäärin 51 %:n lasku, ja seuraavaksi eniten vaikutti pyritiostrobiini. Muissa tutkimuksissa ei kuitenkaan ole raportoitu sienitautien torjunta-aineiden kenttäannosten haittavaikutuksista toukkavaiheisiin44. Vaikka ditiokarbamaattibiosidien on osoitettu olevan akuuttia myrkyllisyyttä vähäistä45, etyleenibisditiokarbamaatit (EBDCS), kuten mankotsebi, voivat hajota ureaetyleenisulfidiksi. Ottaen huomioon sen mutageeniset vaikutukset muihin eläimiin, tämä hajoamistuote voi olla vastuussa havaituista vaikutuksista46,47. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että etyleenitiourean muodostumiseen vaikuttavat tekijät, kuten kohonnut lämpötila48, kosteustasot49 ja tuotteen varastoinnin kesto50. Biosidien asianmukaiset varastointiolosuhteet voivat lieventää näitä sivuvaikutuksia. Lisäksi Euroopan elintarviketurvallisuusviranomainen on ilmaissut huolensa pyritiopidin myrkyllisyydestä, jonka on osoitettu olevan syöpää aiheuttava muiden eläinten ruoansulatusjärjestelmille51.
Mankotsebin, pyritiostrobiinin ja trifloksistrobiinin suun kautta antaminen lisää maissikoisan toukkien kuolleisuutta. Sitä vastoin myklobutaniililla, siprosykliinillä ja kaptaanilla ei ollut vaikutusta kuolleisuuteen. Nämä tulokset eroavat Ladurnerin ym.52 tuloksista, jotka osoittivat, että kaptaani vähensi merkittävästi aikuisten O. lignarian ja Apis mellifera L.:n (Hymenoptera, Apisidae) eloonjäämistä. Lisäksi fungisidien, kuten kaptaanin ja boskalidin, on havaittu aiheuttavan toukkien kuolleisuutta52,53,54 tai muuttavan ruokailukäyttäytymistä55. Nämä muutokset puolestaan voivat vaikuttaa siitepölyn ravintoarvoon ja lopulta toukkavaiheen energiansaantiin. Kontrolliryhmässä havaittu kuolleisuus oli yhdenmukainen muiden tutkimusten 56,57 kanssa.
Työssämme havaittu koirassuosioinen sukupuolisuhde voidaan selittää tekijöillä, kuten riittämättömällä parittelulla ja huonoilla sääolosuhteilla kukinnan aikana, kuten Vicens ja Bosch ovat aiemmin ehdottaneet O. cornutalle. Vaikka naarailla ja koirailla oli tutkimuksessamme neljä päivää aikaa paritella (aika, jota yleisesti pidetään riittävänä onnistuneeseen paritteluun), vähensimme tarkoituksella valon voimakkuutta stressin minimoimiseksi. Tämä muutos voi kuitenkin tahattomasti häiritä paritteluprosessia61. Lisäksi mehiläiset kokevat useita päiviä epäsuotuisia sääolosuhteita, kuten sadetta ja alhaisia lämpötiloja (<5 °C), jotka voivat myös vaikuttaa negatiivisesti parittelumenestykseen4,23.
Vaikka tutkimuksemme keskittyi koko toukan mikrobiomiin, tuloksemme antavat tietoa bakteeriyhteisöjen mahdollisista suhteista, jotka voivat olla ratkaisevan tärkeitä mehiläisten ravinnonsaannin ja sienitautien torjunta-aineille altistumisen kannalta. Esimerkiksi mankotsebilla käsitellyllä siitepölyllä ruokittujen toukkien mikrobiyhteisön rakenne ja runsaus olivat merkittävästi pienemmät kuin käsittelemättömällä siitepölyllä ruokittujen toukkien. Käsittelemätöntä siitepölyä syövissä toukissa bakteeriryhmät Proteobacteria ja Actinobacteria olivat hallitsevia ja ne olivat pääasiassa aerobisia tai fakultatiivisesti aerobisia. Delftin bakteereilla, jotka yleensä yhdistetään yksin eläviin mehiläislajeihin, tiedetään olevan antibioottista aktiivisuutta, mikä viittaa niiden mahdolliseen suojaavaan rooliin taudinaiheuttajia vastaan. Toinen bakteerilaji, Pseudomonas, oli runsas käsittelemättömällä siitepölyllä ruokittujen toukkien keskuudessa, mutta sen määrä väheni merkittävästi mankotsebilla käsitellyissä toukissa. Tuloksemme tukevat aiempia tutkimuksia, joissa Pseudomonas tunnistettiin yhdeksi yleisimmistä suvuista O. bicornis35:ssä ja muissa yksinäisissä ampiaisissa34. Vaikka Pseudomonas-bakteerin roolista O. cornifronsin terveydessä ei ole kokeellisia tutkimuksia, tämän bakteerin on osoitettu edistävän suojaavien toksiinien synteesiä Paederus fuscipes -kovakuoriaisessa ja edistävän arginiinin aineenvaihduntaa in vitro 35, 65. Nämä havainnot viittaavat potentiaaliseen rooliin virus- ja bakteeripuolustuksessa O. cornifronsin toukkien kehitysaikana. Microbacterium on toinen tutkimuksessamme tunnistettu suku, jonka on raportoitu esiintyvän suurina määrinä mustasotilaskenkäisen toukissa nälkäolosuhteissa 66. O. cornifronsin toukissa mikrobakteerit voivat edistää suoliston mikrobiomin tasapainoa ja kestävyyttä stressiolosuhteissa. Lisäksi Rhodococcus-bakteeria löytyy O. cornifronsin toukista, ja se tunnetaan vieroituskyvyistään 67. Tätä sukua esiintyy myös A. florean suolistossa, mutta hyvin pieninä määrinä 68. Tuloksemme osoittavat useiden geneettisten variaatioiden esiintymisen lukuisissa mikrobien taksoneissa, jotka voivat muuttaa toukkien aineenvaihduntaprosesseja. O. cornifronsin toiminnallisen monimuotoisuuden parempi ymmärtäminen on kuitenkin tarpeen.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tulokset osoittavat, että mankotsebi, pyritiostrobiini ja trifloksistrobiini vähensivät maissikoisan toukkien painonnousua ja lisäsivät kuolleisuutta. Vaikka sienitautien torjunta-aineiden vaikutuksista pölyttäjiin on kasvavaa huolta, on tarpeen ymmärtää paremmin näiden yhdisteiden jäännösmetaboliittien vaikutuksia. Nämä tulokset voidaan sisällyttää suosituksiin integroiduista pölyttäjien torjuntaohjelmista, jotka auttavat viljelijöitä välttämään tiettyjen sienitautien torjunta-aineiden käyttöä ennen hedelmäpuiden kukintaa ja sen aikana valitsemalla sienitautien torjunta-aineita ja vaihtelemalla levityksen ajoitusta tai kannustamalla vähemmän haitallisten vaihtoehtojen käyttöön36. Nämä tiedot ovat tärkeitä torjunta-aineiden käyttöä koskevien suositusten kehittämisen kannalta, kuten olemassa olevien ruiskutusohjelmien mukauttaminen ja ruiskutusajoituksen muuttaminen sienitautien torjunta-aineita valittaessa tai vähemmän vaarallisten vaihtoehtojen käytön edistäminen. Lisätutkimuksia tarvitaan sienitautien torjunta-aineiden haittavaikutuksista sukupuolijakautumiseen, ruokailukäyttäytymiseen, suoliston mikrobiomiin ja maissikoisan painonpudotuksen ja kuolleisuuden taustalla oleviin molekyylimekanismeihin.
Kuvien 1 ja 2 lähdetiedot 1, 2 ja 3 on talletettu figshare-tietovarastoon DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 ja https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. Tässä tutkimuksessa analysoidut sekvenssit (kuvat 4, 5) ovat saatavilla NCBI SRA -tietovarastossa talletusnumerolla PRJNA1023565.
Bosch, J. ja Kemp, WP Mehiläislajien kehitys ja vakiintuminen maatalouskasvien pölyttäjiksi: esimerkkinä Osmia-suvusta. (Hymenoptera: Megachilidae) ja hedelmäpuista. bull. Ntomore. resource. 92, 3–16 (2002).
Parker, MG ym. Pölytyskäytännöt ja käsitykset vaihtoehtoisista pölyttäjistä omenanviljelijöiden keskuudessa New Yorkissa ja Pennsylvaniassa. päivitys. Maatalous. Ruokajärjestelmät. 35, 1–14 (2020).
Koch I., Lonsdorf EW, Artz DR, Pitts-Singer TL ja Ricketts TH Mantelien pölytyksen ekologia ja taloustiede alkuperäismehiläisten avulla. J. Economics. Ntomore. 111, 16–25 (2018).
Lee, E., He, Y., ja Park, Y.-L. Ilmastonmuutoksen vaikutukset tragopanien fenologiaan: populaation hallintaan liittyviä seikkoja. Climb. Change 150, 305–317 (2018).
Artz, DR ja Pitts-Singer, TL Fungisidi- ja adjuvanttisumutteiden vaikutus kahden erakkomehiläisen (Osmia lignaria ja Megachile rotundata) pesimäkäyttäytymiseen. PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. ym. Vähämyrkyllinen viljelykasvien sienitautien torjunta-aine (fenbukonatsoli) häiritsee urosten lisääntymiskykyä kuvaavia signaaleja, mikä johtaa villien erakkomehiläisten parittelumenestyksen heikkenemiseen. J. Apps. ecology. 59, 1596–1607 (2022).
Sgolastra F. ym. Neonikotinoideihin perustuvat hyönteismyrkyt ja ergosterolibiosynteesi vähentävät synergististä sienitautien torjunta-aineiden kuolleisuutta kolmella mehiläislajilla. Pest control. the science. 73, 1236–1243 (2017).
Kuhneman JG, Gillung J, Van Dyck MT, Fordyce RF. ja Danforth BN Yksinäiset ampiaistoukat muuttavat siitepölyn toimittamaa bakteerien monimuotoisuutta varressa pesiville mehiläisille Osmia cornifrons (Megachilidae). front. microorganism. 13, 1057626 (2023).
Dharampal PS, Danforth BN ja Steffan SA Fermentoidun siitepölyn ektosymbioottiset mikro-organismit ovat yhtä tärkeitä erakkomehiläisten kehitykselle kuin itse siitepöly. ekologia. evoluutio. 12. e8788 (2022).
Kelderer M, Manici LM, Caputo F ja Thalheimer M. Rivien välinen istutus omenatarhoissa uudelleenkylvötautien torjumiseksi: käytännön tehokkuustutkimus mikrobi-indikaattoreiden perusteella. Plant Soil 357, 381–393 (2012).
Martin PL, Kravchik T., Khodadadi F., Achimovich SG ja Peter KA Omenoiden katkeramätäisyys Yhdysvaltojen Atlantin keskiosissa: aiheuttajalajien arviointi sekä alueellisten sääolosuhteiden ja lajikkeiden alttiuden vaikutus. Phytopathology 111, 966–981 (2021).
Cullen MG, Thompson LJ, Carolan JK, Stout JK ja Stanley DA Sienitautien ja rikkakasvien torjunta-aineet sekä mehiläiset: systemaattinen katsaus olemassa olevaan tutkimukseen ja menetelmiin. PLoS One 14, e0225743 (2019).
Pilling, ED ja Jepson, PC. EBI-sienitautien torjunta-aineiden ja pyretroidihyönteismyrkkyjen synergistiset vaikutukset mehiläisiin (Apis mellifera). Pests the Science. 39, 293–297 (1993).
Mussen, EC, Lopez, JE ja Peng, CY Valittujen sienitautien torjunta-aineiden vaikutus mehiläistoukkien Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) kasvuun ja kehitykseen. Wednesday. Ntomore. 33, 1151-1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D. ja McArt, S. Päätösopas torjunta-aineiden käyttöön pölyttäjien suojelemiseksi puutarhoissa (Cornellin yliopisto, 2018).
Iwasaki, JM ja Hogendoorn, K. Mehiläisten altistuminen muille kuin torjunta-aineille: katsaus menetelmiin ja raportoituihin tuloksiin. Maatalous. Ekosysteemi. Keskiviikko. 314, 107423 (2021).
Kopit AM, Klinger E, Cox-Foster DL, Ramirez RA ja Pitts-Singer TL Tarjontatyypin ja torjunta-ainealtistuksen vaikutus Osmia lignarian (Hymenoptera: Megachilidae) toukkien kehitykseen. Keskiviikko. Ntomore. 51, 240–251 (2022).
Kopit AM ja Pitts-Singer TL Yksinäisten tyhjäpesämehiläisten torjunta-aineille altistumisen reitit. Keskiviikko. Ntomore. 47, 499–510 (2018).
Pan, NT ym. Uusi nielemiseen perustuva biomääritysprotokolla torjunta-aineiden myrkyllisyyden arvioimiseksi aikuisilla japanilaisilla puutarhamehiläisillä (Osmia cornifrons). The Science. Reports 10, 9517 (2020).
Julkaisun aika: 14.5.2024