Männyn sukkulamato on karanteenissa muuttava endoparasiitti, jonka tiedetään aiheuttavan vakavia taloudellisia menetyksiä mäntymetsäekosysteemeissä. Tässä tutkimuksessa tarkastellaan halogenoitujen indolien nematisidistä aktiivisuutta mäntyankeroille ja niiden vaikutusmekanismia. 5-jodi-indolin ja avermektiinin (positiivinen kontrolli) nematisidiset aktiivisuudet männyn sukkulamatoja vastaan olivat samanlaisia ja korkeita alhaisilla pitoisuuksilla (10 μg/ml). 5-jodoindoli vähensi hedelmällisyyttä, lisääntymisaktiivisuutta, alkio- ja toukkakuolleisuutta sekä liikkumiskäyttäytymistä. Ligandien molekulaariset vuorovaikutukset selkärangattomien spesifisten glutamaattiporttien kloridikanavareseptorien kanssa tukevat käsitystä, että 5-jodi-indoli, kuten avermektiini, sitoutuu tiukasti reseptorin aktiiviseen kohtaan. 5-jodoindoli aiheutti myös erilaisia fenotyyppisiä muodonmuutoksia sukkulamadoissa, mukaan lukien epänormaali elimen romahdus/kutistuminen ja lisääntynyt vakuolisaatio. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vakuoleilla voi olla rooli sukkulamatojen metylaatiovälitteisessä kuolemassa. Tärkeää on, että 5-jodi-indoli ei ollut myrkyllinen molemmille kasvilajeille (kaali ja retiisi). Siten tämä tutkimus osoittaa, että jodoindolin käyttö ympäristöolosuhteissa voi hallita männyn lakastumisvaurioita.
Männyn sukkulamadot (Bursaphelenchus xylophilus) kuuluu mäntyankeroisiin (PWN), vaeltaviin sisäloissukkulamadoihin, joiden tiedetään aiheuttavan vakavia ekologisia vahinkoja mäntymetsän ekosysteemeille1. Männyn sukkulamatoden aiheuttamasta männyn kuihtumistaudista (PWD) on tulossa vakava ongelma useilla mantereilla, myös Aasiassa ja Euroopassa, ja Pohjois-Amerikassa sukkulamato tuhoaa tuotuja mäntylajeja1,2. Männyn väheneminen on suuri taloudellinen ongelma, ja sen maailmanlaajuisen leviämisen mahdollisuus on huolestuttava3. Sukkulamato hyökkää yleisimmin seuraaviin mäntylajeihin: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ja Pinus radiata4. Männyn sukkulamato on vakava sairaus, joka voi tappaa mäntyjä viikkojen tai kuukausien kuluessa tartunnasta. Lisäksi männyn sukkulamatoepidemiat ovat yleisiä useissa ekosysteemeissä, joten pysyviä infektioketjuja on muodostunut1.
Bursaphelenchus xylophilus on karanteenikasvien loissukkulamaatti, joka kuuluu Aphelenchoidea-superheimoon ja kladiin 102.5. Sukkulamato ruokkii sieniä ja lisääntyy mäntyjen puukudoksissa kehittyen neljään eri toukkavaiheeseen: L1, L2, L3, L4 ja aikuinen yksilö1,6. Ruokapulan olosuhteissa männyn sukkulamaat siirtyy erikoistuneeseen toukkavaiheeseen – daueriin, joka loistaa sen vektorin – männynkuorikuoriaiseen (Monochamus alternatus) ja siirtyy terveisiin mäntyihin. Terveissä isännissä sukkulamadot kulkeutuvat nopeasti kasvikudosten läpi ja syövät parenkymatoottisia soluja, mikä johtaa useisiin yliherkkyysreaktioihin, männyn kuihtumiseen ja kuolemaan vuoden sisällä tartunnan jälkeen1,7,8.
Männyn sukkulamatojen biologinen torjunta on ollut haaste pitkään, ja karanteenitoimenpiteet ovat peräisin 1900-luvulta. Nykyiset mäntyankeroiden torjuntastrategiat sisältävät pääasiassa kemiallisia käsittelyjä, mukaan lukien puun kaasutus ja nematisidien istuttaminen puunrunkoon. Yleisimmin käytetyt nematisidit ovat avermektiini ja avermektiinibentsoaatti, jotka kuuluvat avermektiinien perheeseen. Nämä kalliit kemikaalit ovat erittäin tehokkaita monia sukkulamatolajeja vastaan, ja niitä pidetään ympäristön kannalta turvallisina9. Näiden sukkulamyrkkien toistuvan käytön odotetaan kuitenkin luovan selektiopainetta, joka johtaa lähes varmasti vastustuskykyisten mäntyankeroisten syntymiseen, kuten on osoitettu useille tuhohyönteisille, kuten Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella ja sukkulamadot Trichostrongylus colubriformis ja Ostertagia circumcincta, jotka ovat vähitellen kehittäneet vastustuskykyä10,10,10,10,10,10. Siksi resistenssimalleja on tutkittava säännöllisesti ja nematisidejä seulottava jatkuvasti vaihtoehtoisten, kustannustehokkaiden ja ympäristöystävällisten toimenpiteiden löytämiseksi PVD:n hallitsemiseksi. Viime vuosikymmeninä useat kirjoittajat ovat ehdottaneet kasviuutteiden, eteeristen öljyjen ja haihtuvien aineiden käyttöä sukkulamatojen torjunta-aineina13,14,15,16.
Osoitimme äskettäin indolin, solujen ja valtakuntien välisen signaalimolekyylin, nematisidisen vaikutuksen Caenorhabditis elegansissa 17 . Indoli on laajalle levinnyt solunsisäinen signaali mikrobiekologiassa, ja se ohjaa lukuisia toimintoja, jotka vaikuttavat mikrobien fysiologiaan, itiöiden muodostukseen, plasmidin stabiilisuuteen, lääkeresistenssiin, biofilmin muodostukseen ja virulenssiin 18, 19 . Indolin ja sen johdannaisten aktiivisuutta muita patogeenisiä sukkulamatoja vastaan ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa tutkimme 34 indolin nematisidista aktiivisuutta männyn sukkulamatoja vastaan ja selvitimme tehokkaimman 5-jodi-indolin vaikutusmekanismia mikroskopialla, time-lapse-valokuvauksella ja molekyylitelakointikokeiden avulla sekä arvioimme sen myrkyllisiä vaikutuksia kasveihin käyttämällä siementen itämismääritystä.
Indolin korkeilla pitoisuuksilla (> 1,0 mM) on aiemmin raportoitu olevan nematisidinen vaikutus sukkulamatodeihin17. Sen jälkeen, kun B. xylophilus (sekalaiset elinvaiheet) oli käsitelty indolilla tai 33 eri indolijohdannaisella pitoisuudessa 1 mM, B. xylophiluksen kuolleisuus mitattiin laskemalla elävät ja kuolleet sukkulamadot kontrolli- ja käsitellyissä ryhmissä. Viisi indolia osoitti merkittävää nematisidista aktiivisuutta; käsittelemättömän kontrolliryhmän eloonjäämisaste oli 95 ± 7 % 24 tunnin jälkeen. Testatusta 34 indolista 5-jodi-indoli ja 4-fluoroindoli pitoisuutena 1 mM aiheuttivat 100 % kuolleisuuden, kun taas 5,6-difluorindigo, metyyli-indoli-7-karboksylaatti ja 7-jodi-indoli aiheuttivat noin 50 %:n kuolleisuuden (taulukko 1).
5-jodoindolin vaikutus männyn sukkulamatojen vakuolien muodostumiseen ja aineenvaihduntaan. (A) Avermektiinin ja 5-jodi-indolin vaikutus aikuisiin urossukkulamaatoihin, (B) L1-vaiheen sukkulamatojen muniin ja (C) B. xylophiluksen metaboliaan, (i) vakuoleja ei havaittu 0 tunnin kohdalla, käsittely johti (ii) vakuoleihin, (iii) useiden vakuolien kerääntymiseen, (iv) useiden vakuoleiden turpoamiseen tyhjiöt ja (vi) jättimäisten tyhjiöiden muodostuminen. Punaiset nuolet osoittavat vakuolien turpoamista, siniset nuolet osoittavat tyhjiöiden fuusioitumista ja mustat nuolet osoittavat jättimäisiä vakuoleja. Mittakaava = 50 μm.
Lisäksi tässä tutkimuksessa kuvattiin myös peräkkäinen metaanin aiheuttama kuolema mäntyankeroisissa (kuva 4C). Metanogeeninen kuolema on ei-apoptoottinen solukuoleman tyyppi, joka liittyy näkyvien sytoplasmisten vakuolien kertymiseen27. Männyn sukkulamatoissa havaitut morfologiset viat näyttävät liittyvän läheisesti metaanin aiheuttaman kuoleman mekanismiin. Mikroskooppinen tutkimus eri aikoina osoitti, että jättimäisiä tyhjiöitä muodostui 20 tunnin altistuksen jälkeen 5-jodi-indolille (0,1 mM). Mikroskooppisia vakuoleja havaittiin 8 tunnin hoidon jälkeen, ja niiden lukumäärä kasvoi 12 tunnin kuluttua. Useita suuria vakuoleja havaittiin 14 tunnin kuluttua. Useita fuusioituneita vakuoleja oli selvästi näkyvissä 12–16 tunnin hoidon jälkeen, mikä osoittaa, että vakuolifuusio on metanogeenisen kuoleman mekanismin perusta. 20 tunnin kuluttua madosta löydettiin useita jättimäisiä tyhjiöitä. Nämä havainnot edustavat ensimmäistä raporttia metuoosista C. elegansissa.
5-jodi-indolilla käsitellyissä matoissa havaittiin myös vakuolien aggregaatiota ja repeytymistä (kuvio 5), mistä on osoituksena madon taipuminen ja tyhjiön vapautuminen ympäristöön. Vacuole häiriö havaittiin myös munankuoren kalvo, joka on normaalisti säilynyt ehjänä L2 kuoriutumisen aikana (lisäkuva S2). Nämä havainnot tukevat nesteen kertymisen ja osmoregulaatiohäiriön sekä reversiibelin soluvaurion (RCI) osallisuutta vakuolien muodostumis- ja märkämisprosessissa (kuvio 5).
Olettaen jodin roolia havaituissa vakuolien muodostumisessa, tutkimme natriumjodidin (NaI) ja kaliumjodidin (KI) nematisidista aktiivisuutta. Kuitenkin pitoisuuksilla (0,1, 0,5 tai 1 mM), ne eivät vaikuttaneet joko sukkulamatojen eloonjäämiseen tai vakuolien muodostumiseen (täydentävä kuva S5), vaikka 1 mM KI:lla oli lievä nematisidinen vaikutus. Toisaalta 7-jodoindoli (1 tai 2 mM), kuten 5-jodoindoli, aiheutti useita vakuoleja ja rakenteellisia muodonmuutoksia (lisäkuva S6). Kahdella jodoindolilla oli samanlaisia fenotyyppisiä ominaisuuksia mäntyankeroisissa, kun taas NaI ja KI eivät. Mielenkiintoista on, että indoli ei indusoinut vakuolien muodostumista B. xylophiluksessa testatuilla pitoisuuksilla (tietoja ei esitetä). Siten tulokset vahvistivat, että indoli-jodikompleksi on vastuussa B. xylophiluksen vakuolisaatiosta ja metaboliosta.
Nematisidisen aktiivisuuden suhteen testattujen indolien joukossa 5-jodoindolilla oli korkein liukuindeksi -5,89 kcal/mol, jota seurasivat 7-jodoindoli (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindoli (-4,33) ja indoli (-4,03) (kuvio 6). 5-jodi-indolin vahva runkovetysidos leusiiniin 218 stabiloi sen sitoutumista, kun taas kaikki muut indolijohdannaiset sitoutuvat seriiniin 260 sivuketjun vetysidosten kautta. Muiden mallinnettujen jodoindolien joukossa 2-jodoindolin sitoutumisarvo on -5,248 kcal/mol, mikä johtuu sen päävetysidoksesta leusiini 218:n kanssa. Muita tunnettuja sitoutumisia ovat 3-jodi-indoli (-4,3 kcal/mol), 4-jodi-indoli (-4,0 kcal/mol) ja 6,0 kcal/mol-2-fluoroindoli. kcal/mol) (lisäkuva S8). Useimmat halogenoidut indolit ja itse indoli, lukuun ottamatta 5-jodi-indolia ja 2-jodi-indolia, muodostavat sidoksen seriinin 260 kanssa. Se, että vetysidos leusiinin 218 kanssa on osoitus tehokkaasta reseptoriligandin sitoutumisesta, kuten ivermektiinille havaittiin (täydentävä kuva S5- ja iodoindoindole-io), 2-jodi-indoli, kuten ivermektiini, sitoutuu tiukasti GluCL-reseptorin aktiiviseen kohtaan leusiini 218:n kautta (kuva 6 ja täydentävä kuva S8). Ehdotamme, että tämä sitoutuminen on välttämätöntä GluCL-kompleksin avoimen huokosrakenteen ylläpitämiseksi ja että sitoutumalla tiukasti GluCL-reseptorin aktiiviseen kohtaan 5-jodoindoli, 2-jodoindoli, avermektiini ja ivermektiini pitävät siten ionikanavan auki ja mahdollistavat nesteen oton.
Indolin ja halogenoidun indolin molekyylitelakka GluCL:ään. (A) indolin, (B) 4-fluoroindolin, (C) 7-jodoindolin ja (D) 5-jodi-indolin ligandien sitoutumisorientaatiot GluCL:n aktiiviseen kohtaan. Proteiinia edustaa nauha, ja rungon vetysidokset esitetään keltaisina katkoviivoina. (A'), (B'), (C') ja (D') osoittavat vastaavien ligandien vuorovaikutuksia ympäröivien aminohappotähteiden kanssa, ja sivuketjun vetysidokset on osoitettu vaaleanpunaisilla katkovilla nuolilla.
Kokeita suoritettiin 5-jodi-indolin myrkyllisen vaikutuksen arvioimiseksi kaalin ja retiisin siementen itävyyteen. 5-jodi-indolilla (0,05 tai 0,1 mM) tai avermektiinillä (10 μg/ml) oli vain vähän tai ei ollenkaan vaikutusta alkuperäiseen itämiseen ja kasvien syntymiseen (kuva 7). Lisäksi ei havaittu merkitsevää eroa käsittelemättömien kontrollien ja 5-jodoindolilla tai avermektiinillä käsiteltyjen siementen itämisnopeuden välillä. Vaikutus tajuuren pidennykseen ja muodostuneiden sivujuurien lukumäärään oli merkityksetön, vaikka 1 mM (10 kertaa sen aktiivinen pitoisuus) 5-jodoindolia viivästytti hieman sivujuurien kehittymistä. Nämä tulokset osoittavat, että 5-jodoindoli ei ole myrkyllinen kasvisoluille eikä häiritse kasvin kehitysprosesseja tutkituilla pitoisuuksilla.
5-jodoindolin vaikutus siementen itämiseen. B. oleracean ja R. raphanistrum -siementen itäminen, itäminen ja juurtuminen sivusuunnassa Murashige- ja Skoog-agar-elatusaineella avermektiinin tai 5-jodoindolin kanssa tai ilman. Itäminen rekisteröitiin 3 päivän inkuboinnin jälkeen 22 °C:ssa.
Tämä tutkimus raportoi useita tapauksia, joissa indolit ovat tappaneet sukkulamatoja. Tärkeää on, että tämä on ensimmäinen raportti jodoindolin indusoimisesta metylaatiosta (prosessi, jonka aiheuttaa pienten tyhjiöiden kerääntyminen, jotka sulautuvat vähitellen jättimäisiksi tyhjiöiksi, mikä lopulta johtaa kalvon repeytymiseen ja kuolemaan) männyn neuloissa, ja jodoindolilla on merkittäviä nematisidisia ominaisuuksia, jotka ovat samanlaisia kuin kaupallisella nematisidilla.
Indolien on aiemmin raportoitu käyttävän useita signalointitoimintoja prokaryooteissa ja eukaryooteissa, mukaan lukien biofilmin esto/muodostus, bakteerien eloonjääminen ja patogeenisyys19, 32, 33, 34. Viime aikoina halogenoitujen indolien, indolialkaloidien ja puolisynteettisten indolijohdannaisten mahdolliset terapeuttiset vaikutukset ovat herättäneet laajaa tutkimuskiinnostusta35, 36, 37. Esimerkiksi halogenoitujen indolien on osoitettu tappavan pysyviä Escherichia coli- ja Staphylococcus aureus -soluja37. Lisäksi on tieteellistä mielenkiintoa tutkia halogenoitujen indolien tehoa muita lajeja, sukuja ja valtakuntia vastaan, ja tämä tutkimus on askel kohti tämän tavoitteen saavuttamista.
Tässä ehdotamme mekanismia 5-jodi-indolin aiheuttamaa kuolleisuutta varten C. elegansissa, joka perustuu palautuvaan soluvaurioon (RCI) ja metylaatioon (kuvat 4C ja 5). Turvotusmuutokset, kuten turvotus ja vakuolaarinen rappeuma, ovat RCI:n ja metylaation indikaattoreita, jotka ilmenevät jättimäisinä vakuoleina sytoplasmassa48,49. RCI häiritsee energian tuotantoa vähentämällä ATP:n tuotantoa, aiheuttaen ATPaasipumpun toimintahäiriön tai häiritsemällä solukalvoja ja aiheuttaen nopean Na+-, Ca2+- ja veden virtauksen50,51,52. Intrasytoplasmiset tyhjiöt syntyvät eläinsoluissa nesteen kertymisen seurauksena sytoplasmaan Ca2+:n ja veden sisäänvirtauksen seurauksena53. Mielenkiintoista on, että tämä soluvaurion mekanismi on palautuva, jos vaurio on väliaikainen ja solut alkavat tuottaa ATP:tä tietyn ajan, mutta jos vaurio jatkuu tai pahenee, solut kuolevat.54 Havaintomme osoittavat, että 5-jodi-indolilla käsitellyt sukkulamadot eivät pysty palauttamaan normaalia biosynteesiä stressiolosuhteille altistumisen jälkeen.
5-jodoindolin B. xylophiluksessa indusoima metylaatiofenotyyppi saattaa johtua jodin läsnäolosta ja sen molekyylijakaumasta, koska 7-jodoindolilla oli vähemmän estävä vaikutus B. xylophilukseen kuin 5-jodoindolilla (taulukko 1 ja täydentävä kuva S6). Nämä tulokset ovat osittain yhdenmukaisia Maltese et al. (2014), joka raportoi, että pyridyylityppiosan translokaatio indolissa para-asemasta meta-asemaan poisti vakuolisoitumisen, kasvun eston ja sytotoksisuuden U251-soluissa, mikä viittaa siihen, että molekyylin vuorovaikutus proteiinin spesifisen aktiivisen kohdan kanssa on kriittinen 27, 44, 45. Tässä tutkimuksessa havaitut indoli- tai halogenoitujen indolien ja GluCL-reseptorien väliset vuorovaikutukset tukevat myös tätä käsitystä, koska 5- ja 2-jodi-indolin havaittiin sitoutuvan GluCL-reseptoreihin voimakkaammin kuin muiden tutkittujen indolien (kuva 6 ja täydentävä kuva S8). Indolin toisessa tai viidennessä asemassa olevan jodin havaittiin sitoutuvan GluCL-reseptorin leusiiniin 218 pääketjun vetysidosten kautta, kun taas muut halogenoidut indolit ja indoli itse muodostavat heikkoja sivuketjuisia vetysidoksia seriinin 260 kanssa (kuva 6). Siksi spekuloimme, että halogeenin lokalisaatiolla on tärkeä rooli tyhjiödegeneraation induktiossa, kun taas 5-jodi-indolin tiukka sitoutuminen pitää ionikanavan auki, mikä mahdollistaa nopean nesteen sisäänvirtauksen ja tyhjiön repeämisen. 5-jodoindolin yksityiskohtainen vaikutusmekanismi on kuitenkin vielä määrittämättä.
Ennen 5-jodoindolin käytännön käyttöä sen myrkyllinen vaikutus kasveihin tulee analysoida. Siementen itämiskokeemme osoittivat, että 5-jodi-indolilla ei ollut negatiivista vaikutusta siementen itämiseen tai myöhempään kehitysprosesseihin tutkituilla pitoisuuksilla (kuva 7). Siten tämä tutkimus tarjoaa perustan 5-jodoindolin käytölle ekologisessa ympäristössä männyn sukkulamatojen haitallisuuden hallintaan mäntypuille.
Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että indolipohjainen hoito on mahdollinen lähestymistapa antibioottiresistenssin ja syövän etenemisen ongelman ratkaisemiseksi55. Lisäksi indoleilla on antibakteerisia, syöpää, antioksidantteja, anti-inflammatorisia, diabeteksen vastaisia, virustenvastaisia, antiproliferatiivisia ja tuberkuloosin vastaisia vaikutuksia, ja ne voivat toimia lupaavana perustana lääkekehityksessä56,57. Tämä tutkimus ehdottaa ensimmäistä kertaa jodin mahdollista käyttöä loisia estävänä ja anthelminttisenä aineena.
Avermektiini löydettiin kolme vuosikymmentä sitten ja voitti Nobel-palkinnon vuonna 2015, ja sen käyttö lääkityksenä jatkuu edelleen aktiivisesti. Koska sukkulamatojen ja tuhohyönteisten resistenssi avermektiineille kehittyy kuitenkin nopeasti, tarvitaan vaihtoehtoinen, edullinen ja ympäristöystävällinen strategia mäntypuiden mäntyankeroisen tartunnan torjumiseksi. Tässä tutkimuksessa kerrotaan myös mekanismista, jolla 5-jodoindoli tappaa männyn sukkulamatoja ja että 5-jodoindoli on alhainen toksisuus kasvisoluille, mikä avaa hyvät mahdollisuudet sen tulevalle kaupalliselle sovellukselle.
Kaikki kokeet hyväksyi Yeungnam Universityn eettinen komitea, Gyeongsan, Korea, ja menetelmät suoritettiin Yeungnamin yliopiston eettisen komitean ohjeiden mukaisesti.
Muna-inkubointikokeet suoritettiin vakiintuneita menetelmiä käyttäen43. Kuoriutumisnopeuden (HR) arvioimiseksi 1 päivän ikäisiä aikuisia sukkulamatoja (noin 100 naarasta ja 100 urosta) siirrettiin sienen sisältäville petrimaljoille ja annettiin kasvaa 24 tuntia. Sitten munat eristettiin ja käsiteltiin 5-jodi-indolilla (0,05 mM ja 0,1 mM) tai avermektiinillä (10 μg/ml) suspensiona steriilissä tislatussa vedessä. Nämä suspensiot (500 μl; noin 100 munaa) siirrettiin 24-kuoppaisen kudosviljelylevyn kuoppiin ja inkuboitiin 22 °C:ssa. L2-laskelmat tehtiin 24 tunnin inkubaation jälkeen, mutta niitä pidettiin kuolleina, jos solut eivät liikkuneet, kun niitä stimuloitiin hienolla platinalangalla. Tämä koe suoritettiin kahdessa vaiheessa, joissa kussakin oli kuusi toistoa. Molempien kokeiden tiedot yhdistettiin ja esitettiin. HR-prosentti lasketaan seuraavasti:
Toukkien kuolleisuus arvioitiin käyttämällä aiemmin kehitettyjä menetelmiä. Sukkulamatomunat kerättiin ja alkiot synkronoitiin kuoriutumalla steriilissä tislatussa vedessä L2-vaiheen toukkien muodostamiseksi. Synkronoituja toukkia (noin 500 sukkulamadot) käsiteltiin 5-jodi-indolilla (0,05 mM ja 0,1 mM) tai avermektiinillä (10 µg/ml) ja kasvatettiin B. cinerea Petri -maljoilla. 48 tunnin inkubaation jälkeen 22 °C:ssa sukkulamadot kerättiin steriiliin tislattuun veteen ja tutkittiin L2-, L3- ja L4-vaiheiden läsnäolo. L3- ja L4-vaiheiden läsnäolo osoitti toukkien transformaatiota, kun taas L2-vaiheen läsnäolo osoitti, ettei transformaatiota ollut. Kuvat hankittiin käyttämällä iRiS™ Digital Cell Imaging System -järjestelmää. Tämä koe suoritettiin kahdessa vaiheessa, joissa kussakin oli kuusi toistoa. Molempien kokeiden tiedot yhdistettiin ja esitettiin.
5-jodi-indolin ja avermektiinin myrkyllisyys siemenille arvioitiin itävyystesteillä Murashige- ja Skoog-agar-maljoilla.62 B. oleracean ja R. raphanistrumin siemeniä liotettiin ensin steriilissä tislatussa vedessä yhden päivän ajan, pestiin 1 ml:lla 100 % etanolia, 3 % 1ble, steriloitu 50 % kaupallisella etanolilla. hypokloriitti) 15 minuutin ajan ja pestiin viisi kertaa 1 ml:lla steriiliä vettä. Steriloidut siemenet puristettiin sitten itämisagarmaljoille, jotka sisälsivät 0,86 g/l (0,2X) Murashige- ja Skoog-elatusainetta ja 0,7 % bakteriologista agaria 5-jodi-indolin tai avermektiinin kanssa tai ilman. Levyjä inkuboitiin sitten 22 °C:ssa ja kuvat otettiin 3 päivän inkubaation jälkeen. Tämä koe suoritettiin kahdessa vaiheessa, joista jokaisessa oli kuusi toistoa.
Postitusaika: 26.2.2025