Mäntysukkulamato on karanteenissa elävä vaeltava endoparasiitti, jonka tiedetään aiheuttavan vakavia taloudellisia tappioita mäntymetsien ekosysteemeissä. Tässä tutkimuksessa tarkastellaan halogenoitujen indolien sukkulamatoja tappavaa vaikutusta mäntysukkulamatoja vastaan ja niiden vaikutusmekanismia. 5-jodoindolin ja avermektiinin (positiivinen kontrolli) sukkulamatoja tappava vaikutus oli samanlainen ja voimakas pienillä pitoisuuksilla (10 μg/ml). 5-jodoindoli vähensi hedelmällisyyttä, lisääntymisaktiivisuutta, alkio- ja toukkien kuolleisuutta sekä liikkumiskäyttäytymistä. Ligandin ja selkärangattomille spesifisten glutamaattiriippuvaisten kloridikanavareseptorien molekyylivuorovaikutukset tukevat käsitystä, että 5-jodoindoli, kuten avermektiini, sitoutuu tiukasti reseptorin aktiiviseen kohtaan. 5-jodoindoli aiheutti myös erilaisia fenotyyppisiä muodonmuutoksia sukkulamadoissa, mukaan lukien epänormaalin elinten romahduksen/kutistumisen ja lisääntyneen vakuolisaation. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vakuolit voivat olla osallisena sukkulamatojen metylaation välittämässä kuolemassa. Tärkeää on, että 5-jodoindoli ei ollut myrkyllinen kummallekaan kasvilajille (kaali ja retiisi). Näin ollen tämä tutkimus osoittaa, että jodoindolin käyttö ympäristöolosuhteissa voi hillitä männyn lakastumisvaurioita.
Mäntyankeroinen (Bursaphelenchus xylophilus) kuuluu mäntyankeroisiin (PWN), jotka ovat muuttoloisankeroisia, joiden tiedetään aiheuttavan vakavia ekologisia vahinkoja mäntymetsien ekosysteemeille1. Mäntyankeroisen aiheuttamasta mäntylakastaudista on tulossa vakava ongelma useilla mantereilla, kuten Aasiassa ja Euroopassa, ja Pohjois-Amerikassa sukkulamato tuhoaa tulokasmäntylajeja1,2. Mäntyjen väheneminen on merkittävä taloudellinen ongelma, ja sen maailmanlaajuinen leviäminen on huolestuttavaa3. Seuraavat mäntylajit ovat sukkulamatolle yleisimpiä: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ja Pinus radiata4. Mäntyankeroinen on vakava tauti, joka voi tappaa mäntyjä viikkojen tai kuukausien kuluessa tartunnasta. Lisäksi mäntyankeroisten epidemiat ovat yleisiä useissa ekosysteemeissä, joten pysyviä tartuntaketjuja on muodostunut1.
Bursaphelenchus xylophilus on karanteenissa elävä kasviloissukkulamato, joka kuuluu Aphelenchoidea-yliheimoon ja haaraan 102.5. Sukkulamato syö sieniä ja lisääntyy mäntyjen puukudoksissa kehittyen neljään eri toukkavaiheeseen: L1, L2, L3, L4 ja aikuiseksi yksilöksi1,6. Ravinnonpulan olosuhteissa mäntysukkulamato siirtyy erikoistuneeseen toukkavaiheeseen – daueriin, joka loisii vektorillaan – kaarnakuoriaisella (Monochamus alternatus) – ja siirtyy terveisiin mäntyihin. Terveillä isännillä sukkulamadot kulkeutuvat nopeasti kasvikudosten läpi ja syövät parenkyymisoluja, mikä johtaa lukuisiin yliherkkyysreaktioihin, männyn nuutumiseen ja kuolemaan vuoden sisällä tartunnasta1,7,8.
Mäntysukkulamatojen biologinen torjunta on ollut pitkään haaste, ja karanteenitoimenpiteet ovat peräisin 1900-luvulta. Nykyiset mäntysukkulamatojen torjuntastrategiat sisältävät pääasiassa kemiallisia käsittelyjä, mukaan lukien puun kaasutuksen ja sukkulamatojen torjunta-aineiden istuttamisen puunrunkoihin. Yleisimmin käytetyt sukkulamatojen torjunta-aineet ovat avermektiini ja avermektiinibentsoaatti, jotka kuuluvat avermektiinien perheeseen. Nämä kalliit kemikaalit ovat erittäin tehokkaita monia sukkulamatoja vastaan ja niitä pidetään ympäristölle turvallisina9. Näiden sukkulamatojen toistuvan käytön odotetaan kuitenkin aiheuttavan valintapainetta, joka lähes varmasti johtaa resistenttien mäntysukkulamatojen syntymiseen, kuten on osoitettu useiden hyönteistuholaisten, kuten Leptinotarsa decemlineatan ja Plutella xylostellan, sekä sukkulamatojen Trichostrongylus colubriformis ja Ostertagia circumcinctan, kohdalla, jotka ovat vähitellen kehittäneet resistenssin avermektiineille10,11,12. Siksi resistenssimalleja on tutkittava säännöllisesti ja sukkulamatojen torjunta-aineita seulottava jatkuvasti, jotta löydetään vaihtoehtoisia, kustannustehokkaita ja ympäristöystävällisiä toimenpiteitä PVD:n torjumiseksi. Viime vuosikymmeninä useat kirjoittajat ovat ehdottaneet kasviuutteiden, eteeristen öljyjen ja haihtuvien aineiden käyttöä sukkulamatojen torjunta-aineina13,14,15,16.
Osoitimme hiljattain indolin, solujen ja sukukuntien välisen signalointimolekyylin, sukkulamatomyrkkyvaikutuksen Caenorhabditis elegansissa 17. Indoli on laajalle levinnyt solunsisäinen signaalimolekyyli mikrobien ekologiassa, ja se säätelee lukuisia toimintoja, jotka vaikuttavat mikrobien fysiologiaan, itiöiden muodostumiseen, plasmidien stabiilisuuteen, lääkeresistenssiin, biofilmin muodostumiseen ja virulenssiin 18, 19. Indolin ja sen johdannaisten vaikutusta muita patogeenisiä sukkulamatoja vastaan ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa tutkimme 34 indolin sukkulamatomyrkkyvaikutusta mäntysukkulamatoja vastaan ja selvitimme tehokkaimman 5-jodoindolin vaikutusmekanismia käyttämällä mikroskopiaa, aikaviivekuvausta ja molekyylitelakointikokeita, ja arvioimme sen myrkyllisiä vaikutuksia kasveihin käyttämällä siementen itävyysmääritystä.
Aikaisemmin on raportoitu, että indolin korkeilla pitoisuuksilla (> 1,0 mM) on sukkulamatoja tappava vaikutus17. Kun B. xylophilus -sieniä (sekalaiset elämänvaiheet) oli käsitelty indolilla tai 33 eri indolijohdannaisella 1 mM:n pitoisuudella, B. xylophilus -sienten kuolleisuus mitattiin laskemalla elävät ja kuolleet sukkulamadot kontrolli- ja käsitellyissä ryhmissä. Viidellä indolilla oli merkittävää sukkulamatoja tappavaa vaikutusta; käsittelemättömän kontrolliryhmän eloonjäämisaste oli 95 ± 7 % 24 tunnin kuluttua. Testatuista 34 indolista 5-jodoindoli ja 4-fluoroindoli 1 mM:n pitoisuuksina aiheuttivat 100 %:n kuolleisuuden, kun taas 5,6-difluoroindigo, metyyli-indoli-7-karboksylaatti ja 7-jodoindoli aiheuttivat noin 50 %:n kuolleisuuden (taulukko 1).
5-jodoindolin vaikutus mäntyankeroisen vakuolien muodostumiseen ja metaboliaan. (A) Avermektiinin ja 5-jodoindolin vaikutus aikuisiin urossukkulamatoihin, (B) L1-vaiheen sukkulamatojen munat ja (C) B. xylophilus -sienen metabolia, (i) vakuoleja ei havaittu 0 tunnissa, käsittely johti (ii) vakuoleihin, (iii) useiden vakuolien kertymiseen, (iv) vakuolien turpoamiseen, (v) vakuolien fuusioon ja (vi) jättiläisvakuolien muodostumiseen. Punaiset nuolet osoittavat vakuolien turpoamista, siniset nuolet vakuolien fuusiota ja mustat nuolet jättiläisvakuoleja. Skaala = 50 μm.
Lisäksi tässä tutkimuksessa kuvattiin metaanin aiheuttaman kuoleman peräkkäinen prosessi mäntysukkulamatojen keskuudessa (kuva 4C). Metanogeeninen kuolema on ei-apoptoottinen solukuolematyyppi, joka liittyy merkittävien sytoplasmisten vakuolien kertymiseen27. Mäntysukkulamatojen havaitut morfologiset viat näyttävät olevan läheisessä yhteydessä metaanin aiheuttaman kuoleman mekanismiin. Eri aikoina tehdyt mikroskooppiset tutkimukset osoittivat, että jättimäisiä vakuoleja muodostui 20 tunnin kuluttua altistuksesta 5-jodoindolille (0,1 mM). Mikroskooppisia vakuoleja havaittiin 8 tunnin käsittelyn jälkeen, ja niiden määrä kasvoi 12 tunnin kuluttua. Useita suuria vakuoleja havaittiin 14 tunnin kuluttua. Useita fuusioituneita vakuoleja oli selvästi näkyvissä 12–16 tunnin käsittelyn jälkeen, mikä osoittaa, että vakuolien fuusio on metanogeenisen kuolemanmekanismin perusta. 20 tunnin kuluttua madon sisältä löydettiin useita jättimäisiä vakuoleja. Nämä havainnot edustavat ensimmäistä raporttia metooosista C. elegansissa.
5-jodoindolilla käsitellyillä madoilla havaittiin myös vakuolien aggregaatiota ja repeämistä (kuva 5), mikä ilmenee matojen taipumisena ja vakuolien vapautumisena ympäristöön. Vakuolien hajoamista havaittiin myös munankuoren kalvossa, joka normaalisti säilyy ehjänä L2:n avulla kuoriutumisen aikana (lisäkuva S2). Nämä havainnot tukevat nesteen kertymisen ja osmosäätelyn häiriintymisen sekä palautuvan soluvaurion (RCI) osallistumista vakuolien muodostumis- ja märkimisprosessiin (kuva 5).
Hypoteesina jodin roolista havaitussa vakuolien muodostumisessa tutkimme natriumjodidin (NaI) ja kaliumjodidin (KI) sukkulamatomyrkkyvaikutusta. Pitoisuuksina (0,1, 0,5 tai 1 mM) ne eivät kuitenkaan vaikuttaneet sukkulamatojen selviytymiseen tai vakuolien muodostumiseen (lisäkuva S5), vaikka 1 mM KI:llä oli lievä sukkulamatomyrkkyvaikutus. Toisaalta 7-jodoindoli (1 tai 2 mM), kuten 5-jodoindoli, indusoi useita vakuoleja ja rakenteellisia muodonmuutoksia (lisäkuva S6). Nämä kaksi jodoindolia osoittivat samanlaisia fenotyyppisiä ominaisuuksia mäntysukkulamadoissa, kun taas NaI ja KI eivät. Mielenkiintoista kyllä, indoli ei indusoinut vakuolien muodostumista B. xylophilus -bakteerissa testatuilla pitoisuuksilla (tietoja ei esitetty). Tulokset vahvistivat siis, että indoli-jodikompleksi on vastuussa B. xylophilus -bakteerin vakuolisaatiosta ja metaboliasta.
Sukkulamatomyrkkyvaikutuksen testaamista indoleista 5-jodoindolilla oli korkein liukumisindeksi, -5,89 kcal/mol, jota seurasivat 7-jodoindoli (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindoli (-4,33) ja indoli (-4,03) (kuva 6). 5-jodoindolin vahva vetysidos runkoketjussa leusiiniin 218 stabiloi sen sitoutumista, kun taas kaikki muut indolijohdannaiset sitoutuvat seriiniin 260 sivuketjun vetysidosten kautta. Muiden mallinnettujen jodoindolien joukossa 2-jodoindolilla on sitoutumisarvo -5,248 kcal/mol, mikä johtuu sen pääasiallisesta vetysidoksesta leusiiniin 218. Muita tunnettuja sitoutumisia ovat 3-jodoindoli (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindoli (-4,0 kcal/mol) ja 6-fluoroindoli (-2,6 kcal/mol) (lisäkuva S8). Useimmat halogenoidut indolit ja itse indoli, lukuun ottamatta 5-jodi- ja 2-jodi-indolia, muodostavat sidoksen seriinin 260 kanssa. Se, että vetysidos leusiinin 218 kanssa viittaa tehokkaaseen reseptori-ligandi-sitoutumiseen, kuten ivermektiinillä on havaittu (lisäkuva S7), vahvistaa, että 5-jodi- ja 2-jodi-indoli, kuten ivermektiini, sitoutuvat tiukasti GluCL-reseptorin aktiiviseen kohtaan leusiini 218:n kautta (kuva 6 ja lisäkuva S8). Ehdotamme, että tämä sitoutuminen on välttämätöntä GluCL-kompleksin avoimen huokosrakenteen ylläpitämiseksi ja että sitoutumalla tiukasti GluCL-reseptorin aktiiviseen kohtaan 5-jodi-indoli, 2-jodi-indoli, avermektiini ja ivermektiini pitävät ionikanavan avoimena ja mahdollistavat nesteen imeytymisen.
Indolin ja halogenoidun indolin molekyylitelakointi GluCL:ään. (A) indolin, (B) 4-fluoroindolin, (C) 7-jodi-indolin ja (D) 5-jodi-indoli-ligandien sitoutumisorientaatiot GluCL:n aktiiviseen kohtaan. Proteiinia edustaa nauha, ja rungon vetysidokset on esitetty keltaisilla katkoviivoilla. (A'), (B'), (C') ja (D') osoittavat vastaavien ligandien vuorovaikutukset ympäröivien aminohappotähteiden kanssa, ja sivuketjujen vetysidokset on merkitty vaaleanpunaisilla katkoviivoilla.
Kokeita tehtiin 5-jodoindolin toksisen vaikutuksen arvioimiseksi kaalin ja retiisin siementen itämiseen. 5-jodoindolilla (0,05 tai 0,1 mM) tai avermektiinillä (10 μg/ml) oli vain vähän tai ei lainkaan vaikutusta alkuitämiseen ja taimien ilmestymiseen (kuva 7). Lisäksi ei havaittu merkittävää eroa käsittelemättömien kontrollien ja 5-jodoindolilla tai avermektiinillä käsiteltyjen siementen itämisnopeuden välillä. Vaikutus pääjuurien pidentymiseen ja muodostuneiden sivujuurten määrään oli merkityksetön, vaikka 1 mM (10 kertaa sen aktiivinen pitoisuus) 5-jodoindolia hidasti hieman sivujuurten kehitystä. Nämä tulokset osoittavat, että 5-jodoindoli ei ole myrkyllinen kasvisoluille eikä häiritse kasvien kehitysprosesseja tutkituilla pitoisuuksilla.
5-jodoindolin vaikutus siementen itämiseen. B. oleracean ja R. raphanistrumin siementen itäminen, versominen ja sivuttaisjuurtuminen Murashige- ja Skoog-agarilla, jossa oli tai ei ollut avermektiiniä tai 5-jodoindolia. Itäminen rekisteröitiin 3 päivän inkuboinnin jälkeen 22 °C:ssa.
Tässä tutkimuksessa raportoidaan useita tapauksia, joissa indolit tappavat sukkulamatoja. Merkittävää on, että tämä on ensimmäinen raportti jodoindolin indusoimasta metylaatiosta (prosessi, jonka aiheuttaa pienten vakuolien kertyminen, jotka vähitellen yhdistyvät jättimäisiksi vakuoleiksi, mikä lopulta johtaa kalvon repeämiseen ja kuolemaan) männynneulasissa. Jodoindolilla on merkittäviä sukkulamatoja tappavia ominaisuuksia, jotka ovat samanlaisia kuin kaupallisella sukkulamatojen torjunta-aineella avermektiinillä.
Indolien on aiemmin raportoitu suorittavan useita signalointitehtäviä prokaryooteissa ja eukaryooteissa, mukaan lukien biofilmin esto/muodostuminen, bakteerien selviytyminen ja patogeenisuus19,32,33,34. Viime aikoina halogenoitujen indolien, indolalkaloidien ja puolisynteettisten indolijohdannaisten mahdolliset terapeuttiset vaikutukset ovat herättäneet laajaa tutkimuskiinnostusta35,36,37. Esimerkiksi halogenoitujen indolien on osoitettu tappavan pysyviä Escherichia coli- ja Staphylococcus aureus -soluja37. Lisäksi on tieteellisesti kiinnostavaa tutkia halogenoitujen indolien tehoa muita lajeja, sukuja ja kuningaskuntia vastaan, ja tämä tutkimus on askel kohti tämän tavoitteen saavuttamista.
Tässä työssä ehdotamme mekanismia 5-jodoindolin aiheuttamalle letaliteetille C. elegansissa, joka perustuu palautuvaan soluvaurioon (RCI) ja metylaatioon (kuvat 4C ja 5). Turvotusmuutokset, kuten turvotus ja vakuolaarinen rappeutuminen, ovat indikaattoreita RCI:stä ja metylaatiosta, ja ne ilmenevät jättimäisinä vakuoleina sytoplasmassa48,49. RCI häiritsee energiantuotantoa vähentämällä ATP:n tuotantoa, aiheuttaen ATPaasi-pumpun toimintahäiriön tai hajottamalla solukalvoja ja aiheuttamalla nopean Na+-, Ca2+- ja veden sisäänvirtauksen50,51,52. Sytoplasman sisäiset vakuolit syntyvät eläinsoluissa nesteen kertymisen seurauksena sytoplasmaan Ca2+- ja veden sisäänvirtauksen vuoksi53. Mielenkiintoista on, että tämä soluvauriomekanismi on palautuva, jos vaurio on väliaikainen ja solut alkavat tuottaa ATP:tä tietyn ajan, mutta jos vaurio jatkuu tai pahenee, solut kuolevat.54 Havaintomme osoittavat, että 5-jodoindolilla käsitellyt sukkulamadot eivät pysty palauttamaan normaalia biosynteesiä stressiolosuhteille altistumisen jälkeen.
5-jodoindolin indusoima metylaatiofenotyyppi B. xylophilus -bakteerissa saattaa johtua jodin läsnäolosta ja sen molekyylijakaumasta, koska 7-jodoindolilla oli B. xylophilus -bakteeriin vähemmän estävää vaikutusta kuin 5-jodoindolilla (taulukko 1 ja lisäkuva S6). Nämä tulokset ovat osittain yhdenmukaisia Maltese ym. (2014) tutkimusten kanssa, joissa raportoitiin, että indolin pyridyylityppiosan siirtyminen para-asemasta meta-asemaan poisti vakuolisaation, kasvun estymisen ja sytotoksisuuden U251-soluissa, mikä viittaa siihen, että molekyylin vuorovaikutus proteiinin tietyn aktiivisen kohdan kanssa on kriittinen27,44,45. Tässä tutkimuksessa havaitut indolin tai halogenoitujen indolien ja GluCL-reseptorien väliset vuorovaikutukset tukevat myös tätä käsitystä, sillä 5- ja 2-jodoindolin havaittiin sitoutuvan GluCL-reseptoreihin voimakkaammin kuin muut tutkitut indolit (kuva 6 ja lisäkuva S8). Indolin toisessa tai viidennessä asemassa olevan jodin havaittiin sitoutuvan GluCL-reseptorin leusiiniin 218 runkovetysidosten kautta, kun taas muut halogenoidut indolit ja itse indoli muodostavat heikkoja sivuketjuvetysidoksia seriinin 260 kanssa (kuva 6). Siksi oletamme, että halogeenin lokalisaatiolla on tärkeä rooli vakuolien rappeutumisen indusoinnissa, kun taas 5-jodoindolin tiukka sitoutuminen pitää ionikanavan auki, mikä mahdollistaa nesteen nopean sisäänvirtauksen ja vakuolien repeämisen. 5-jodoindolin yksityiskohtainen vaikutusmekanismi on kuitenkin vielä selvittämättä.
Ennen 5-jodoindolin käytännön käyttöä sen myrkyllinen vaikutus kasveihin tulisi analysoida. Siementen itävyyskokeemme osoittivat, että 5-jodoindolilla ei ollut negatiivista vaikutusta siementen itämiseen tai myöhempiin kehitysprosesseihin tutkituilla pitoisuuksilla (kuva 7). Näin ollen tämä tutkimus tarjoaa perustan 5-jodoindolin käytölle ekologisessa ympäristössä mäntysukkulamatojen haitallisuuden torjumiseksi mäntypuille.
Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että indolipohjainen hoito edustaa mahdollista lähestymistapaa antibioottiresistenssin ja syövän etenemisen ongelman ratkaisemiseksi55. Lisäksi indoleilla on antibakteerisia, syöpää estäviä, antioksidanttisia, tulehdusta estäviä, diabetesta estäviä, antiviraalisia, antiproliferatiivisia ja tuberkuloosia estäviä vaikutuksia, ja ne voivat toimia lupaavana perustana lääkekehitykselle56,57. Tämä tutkimus ehdottaa ensimmäistä kertaa jodin mahdollista käyttöä loisten ja loisten tappajana.
Avermektiini löydettiin kolme vuosikymmentä sitten ja voitti Nobelin palkinnon vuonna 2015, ja sen käyttö loislääkkeenä on edelleen käynnissä. Sukkulamato- ja tuhohyönteisresistenssin nopean kehittymisen vuoksi tarvitaan kuitenkin vaihtoehtoinen, edullinen ja ympäristöystävällinen strategia mäntyankeroistartunnan torjumiseksi männyissä. Tässä tutkimuksessa raportoidaan myös mekanismi, jolla 5-jodoindoli tappaa mäntyankeroisia, ja että 5-jodoindolilla on alhainen myrkyllisyys kasvisoluille, mikä avaa hyviä mahdollisuuksia sen tulevaisuuden kaupallisille sovelluksille.
Kaikki kokeet hyväksyi Yeungnamin yliopiston eettinen toimikunta Gyeongsanissa, Koreassa, ja menetelmät suoritettiin Yeungnamin yliopiston eettisen toimikunnan ohjeiden mukaisesti.
Munien inkubointikokeet tehtiin vakiintuneita menetelmiä käyttäen43. Kuoriutumisasteen (HR) arvioimiseksi yhden päivän ikäiset aikuiset sukkulamadot (noin 100 naarasta ja 100 urosta) siirrettiin sientä sisältäville petrimaljoille ja annettiin kasvaa 24 tuntia. Munat eristettiin ja käsiteltiin 5-jodoindolilla (0,05 mM ja 0,1 mM) tai avermektiinillä (10 μg/ml) suspensiona steriilissä tislatussa vedessä. Nämä suspensiot (500 μl; noin 100 munaa) siirrettiin 24-kuoppaisen kudosviljelylevyn kuoppiin ja inkuboitiin 22 °C:ssa. L2-laskenta tehtiin 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, mutta solut katsottiin kuolleiksi, jos ne eivät liikkuneet, kun niitä stimuloitiin hienolla platinalangalla. Tämä koe suoritettiin kahdessa vaiheessa, joissa kummassakin oli kuusi toistoa. Molempien kokeiden tiedot yhdistettiin ja esitettiin. HR-prosenttiosuus lasketaan seuraavasti:
Toukkien kuolleisuutta arvioitiin aiemmin kehitetyillä menetelmillä. Sukkulamadojen munat kerättiin ja alkiot synkronoitiin kuoriutumalla steriilissä tislatussa vedessä L2-vaiheen toukkien tuottamiseksi. Synkronoituja toukkia (noin 500 sukkulamadoa) käsiteltiin 5-jodoindolilla (0,05 mM ja 0,1 mM) tai avermektiinillä (10 μg/ml) ja kasvatettiin B. cinerea Petri -maljoilla. 48 tunnin inkuboinnin jälkeen 22 °C:ssa sukkulamadot kerättiin steriiliin tislattuun veteen ja tutkittiin L2-, L3- ja L4-vaiheiden esiintyminen. L3- ja L4-vaiheiden esiintyminen osoitti toukkien transformaatiota, kun taas L2-vaiheen esiintyminen ei osoittanut transformaatiota. Kuvat otettiin käyttämällä iRiS™ Digital Cell Imaging System -laitetta. Tämä koe suoritettiin kahdessa vaiheessa, joissa kummassakin oli kuusi toistoa. Molempien kokeiden tiedot yhdistettiin ja esitettiin.
5-Jodaindolin ja avermektiinin myrkyllisyyttä siemenille arvioitiin itävyyskokeilla Murashige- ja Skoog-agarlevyillä.62 B. oleracea- ja R. raphanistrum -siemeniä liotettiin ensin steriilissä tislatussa vedessä yhden päivän ajan, pestiin 1 ml:lla 100 % etanolia, steriloitiin 1 ml:lla 50 % kaupallista valkaisuainetta (3 % natriumhypokloriittia) 15 minuutin ajan ja pestiin viisi kertaa 1 ml:lla steriiliä vettä. Steriloidut siemenet puristettiin sitten idätysagarlevyille, jotka sisälsivät 0,86 g/l (0,2X) Murashige- ja Skoog-elatusainetta ja 0,7 % bakteriologista agaria 5-jodaindolin tai avermektiinin kanssa tai ilman niitä. Levyjä inkuboitiin sitten 22 °C:ssa, ja kuvat otettiin kolmen päivän inkuboinnin jälkeen. Tämä koe suoritettiin kahdessa vaiheessa, joissa kummassakin oli kuusi toistoa.
Julkaisuaika: 26. helmikuuta 2025