Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämäsi selainversiolla on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan tuloksen saavuttamiseksi suosittelemme, että käytät selaimesi uudempaa versiota (tai poistat Internet Explorerin yhteensopivuustilan käytöstä).Jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme tällä välin sivustoa ilman tyyliä tai JavaScriptiä.
Luonnontuotteiden löytäminen ja hyödyllinen käyttö voivat auttaa parantamaan ihmisten elämää.Kasvien kasvua estäviä kemikaaleja käytetään laajalti rikkakasvien torjunta-aineina.Erityyppisten rikkakasvien torjunta-aineiden käyttötarpeen vuoksi on tarvetta tunnistaa yhdisteitä, joilla on uusi vaikutusmekanismi.Tässä tutkimuksessa löysimme uuden N-alkoksipyrroliyhdisteen, koumamonamidin, Streptomyces werraensis MK493-CF1:stä ja loimme täydellisen synteesiprosessin.Biologisten aktiivisuusmääritysten avulla havaitsimme, että urs-monoamihappo on urs-monoamidin synteettinen välituote ja mahdollinenkasvien kasvun estäjä.Lisäksi olemme kehittäneet erilaisia urbenonihappojohdannaisia, mukaan lukien urbenyylioksijohdannainen (UDA), jolla on korkea herbisidinen aktiivisuus vaikuttamatta negatiivisesti HeLa-solujen kasvuun.Havaitsimme myös, että urmotonihappojohdannaiset hajottavat kasvien mikrotubuluksia;lisäksi KAND vaikuttaa aktiinifilamentteihin ja indusoi solukuolemaa;Nämä monitahoiset vaikutukset eroavat tunnettujen mikrotubulusten estäjien vaikutuksista ja viittaavat uuteen ursonihapon vaikutusmekanismiin, joka on tärkeä etu uusien rikkakasvien torjunta-aineiden kehittämisessä.
Hyödyllisten luonnontuotteiden ja niiden johdannaisten löytäminen ja käytännön soveltaminen on keino parantaa ihmisten elämänlaatua.Mikro-organismien, kasvien ja hyönteisten tuottamat sekundääriset metaboliitit ovat johtaneet suuriin edistysaskeliin lääketieteessä ja maataloudessa.Monet antibiootit ja leukemialääkkeet on kehitetty luonnontuotteista.Lisäksi erilaisiatorjunta-aineet, fungisidit ja rikkakasvien torjunta-aineet uutetaan näistä luonnontuotteista käytettäväksi maataloudessa.Erityisesti rikkakasvien torjunta-aineet ovat tärkeitä välineitä sadon lisäämiseksi nykyaikaisessa maataloudessa, ja erilaisia yhdisteitä käytetään jo kaupallisesti.Useita kasveissa tapahtuvia soluprosesseja, kuten fotosynteesi, aminohappojen aineenvaihdunta, soluseinämän synteesi, mitoosin säätely, fytohormonisignalointi tai proteiinisynteesi, pidetään rikkakasvien torjunta-aineiden tyypillisinä kohteina.Mikrotubulusten toimintaa estävät yhdisteet ovat yleinen rikkakasvien torjunta-aineluokka, jotka vaikuttavat kasvien kasvuun vaikuttamalla mitoottiseen säätelyyn2.
Mikrotubulukset ovat sytoskeleton komponentteja ja ovat laajalti konservoituneita eukaryoottisoluissa.Tubuliiniheterodimeeri koostuu α-tubuliinista ja β-tubuliinista, jotka muodostavat lineaarisia mikrotubulusprotofilamentteja, joista 13 protofilamenttia muodostavat sylinterimäisen rakenteen.Mikrotubuluksilla on useita tehtäviä kasvisoluissa, mukaan lukien solun muodon, solun jakautumisen ja solunsisäisen kuljetuksen määrittäminen3,4.Kasvisolut sisältävät mikrotubuluksia faasien välisen plasmakalvon alla, ja näiden niin kutsuttujen aivokuoren mikrotubulusten uskotaan säätelevän selluloosa-mikrofibrillien organisoitumista säätelemällä selluloosasyntaasikomplekseja4,5.Juuren epidermaalisten solujen aivokuoren mikrotubulukset, jotka ovat juurien kärjen nopean venymisen alueella, sijaitsevat sivusuunnassa, ja selluloosa-mikrokuidut seuraavat näitä mikrotubuluksia ja rajoittavat solujen laajenemissuuntaa edistäen siten anisotrooppista solun pidentymistä.Siksi mikrotubulusten toiminta liittyy läheisesti kasvin morfologiaan.Aminohapposubstituutiot tubuliinia koodaavissa geeneissä aiheuttavat aivokuoren mikrotubulusryhmien vinoutumista ja vasemman tai oikean puolen kasvua Arabidopsis 6,7:ssä.Samoin mutaatiot mikrotubuluksiin liittyvissä proteiineissa, jotka säätelevät mikrotubulusten dynamiikkaa, voivat myös johtaa vääristyneeseen juurikasvuun8, 9, 10, 11, 12, 13.Lisäksi käsittely mikrotubuluksia rikkovilla rikkakasvien torjunta-aineilla, kuten disopyramidilla, joka tunnetaan myös nimellä pretilakloori, aiheuttaa myös vasemmanpuoleisen vinon juuren kasvun14.Nämä tiedot osoittavat, että mikrotubulusten toiminnan tarkka säätely on kriittistä kasvin kasvusuunnan määrittämiseksi.
Eri tyyppisiä mikrotubulusten estäjiä on löydetty, ja nämä lääkkeet ovat edistäneet merkittävästi solun luuston tutkimuksessa sekä maataloudessa ja lääketieteessä2.Erityisesti orysaliini, dinitroaniliiniyhdisteet, disopyramidi, bentsamidin sukuiset yhdisteet ja niiden analogit voivat estää mikrotubulusten toimintaa ja siten estää kasvien kasvua.Siksi niitä käytetään laajalti rikkakasvien torjunta-aineina.Koska mikrotubulukset ovat kuitenkin tärkeä komponentti kasvi- ja eläinsoluissa, useimmat mikrotubulusten estäjät ovat sytotoksisia molemmille solutyypeille.Sen vuoksi, huolimatta niiden tunnustetusta hyödyllisyydestä rikkakasvien torjunta-aineina, rajoitettua määrää mikrotubulusten vastaisia aineita käytetään käytännön tarkoituksiin.
Streptomyces on Streptomyces-heimon suku, johon kuuluu aerobisia, grampositiivisia, rihmamaisia bakteereja ja joka tunnetaan laajalti kyvystään tuottaa monenlaisia sekundaarisia metaboliitteja.Siksi sitä pidetään yhtenä tärkeimmistä uusien biologisesti aktiivisten luonnontuotteiden lähteistä.Tässä tutkimuksessa löysimme uuden yhdisteen nimeltä koumamonamidi, joka eristettiin Streptomyces werraensis MK493-CF1:stä ja S. werraensis ISP 5486:sta. Spektrianalyysin ja täydellisen spektrianalyysin avulla karakterisoitiin koumamonamidin rakenne ja sen ainutlaatuinen N-alkoksipyrrolirunko päätettiin.synteesi.Ursmonihapon, ursmonoamidin ja sen johdannaisten synteettisen välituotteen, havaittiin estävän suositun mallikasvin Arabidopsis thaliana kasvua ja itämistä.Rakenne-aktiivisuussuhdetutkimuksessa havaitsimme, että ursonihapoksi modifioitu C9-yhdiste, jota kutsutaan ursonihapon nonyylioksijohdannaiseksi (KAND), tehostaa merkittävästi kasvua ja itämistä estävää vaikutusta.Erityisesti äskettäin löydetty kasvin kasvun estäjä vaikutti myös tupakan ja maksamahan kasvuun, eikä se ollut sytotoksinen bakteereille tai HeLa-soluille.Lisäksi jotkin urmotonihappojohdannaiset aiheuttavat vääristyneen juurifenotyypin, mikä tarkoittaa, että nämä johdannaiset vaikuttavat suoraan tai epäsuorasti mikrotubuluksiin.Tämän ajatuksen mukaisesti havaintomme joko immunohistokemiallisesti tai fluoresoivilla proteiineilla leimatuista mikrotubuluksista osoittavat, että KAND-käsittely depolymeroi mikrotubulukset.Lisäksi käsittely kumamotonihappojohdannaisilla rikkoi aktiinimikrofilamentteja.Siten olemme löytäneet uuden kasvin kasvun estäjän, jonka ainutlaatuinen toimintamekanismi sisältää sytoskeleton tuhoutumisen.
Kanta MK493-CF1 eristettiin maaperästä Shinagawa-kussa Tokiossa.Kanta MK493-CF1 muodosti hyvin haarautuneen stroomarihmaston.16S ribosomaalisen RNA-geenin (1422 bp) osittainen sekvenssi määritettiin.Tämä kanta on hyvin samanlainen kuin S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tyypillinen kanta, 99,93 %).Tämän tuloksen perusteella määritettiin, että tämä kanta oli läheistä sukua S. werraensis -tyyppiselle kannalle.Siksi annoimme tälle kannalle väliaikaisesti S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T tuottaa myös samoja bioaktiivisia yhdisteitä.Koska alkuvaiheessa tutkimusta luonnontuotteiden saamiseksi tästä mikro-organismista oli vähän, tehtiin lisäkemiallisia tutkimuksia.Sen jälkeen, kun S. werraensis MK493-CF1:tä oli viljelty ohraalustalla kiinteässä tilassa 30 °C:ssa 14 päivän ajan, väliaine uutettiin 50-prosenttisella EtOH:lla.60 ml näytettä kuivattiin, jolloin saatiin 59,5 mg raakauutetta.Raakauute altistettiin käänteisfaasi-HPLC:lle, jolloin saatiin N-metoksi-1 H-pyrroli-2-karboksamidi (1, nimeltään kumamonamidi, 36,0 mg).1:n kokonaismäärä on noin 60 % raakauutteesta.Siksi päätimme tutkia yksityiskohtaisesti kumamotoamidi 1:n ominaisuuksia.
Coumamonamid 1 on valkoinen amorfinen jauhe, ja korkearesoluutioinen massaspektrometria (HRESIMS) vahvistaa C6H8N2O2:n (kuva 1).Tämän yhdisteen C2-substituoidulle pyrrolifragmentille on tunnusomaista 8H 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), 8H 6,78 (1H, d, J = 2,5, 8H 1H NMR-spektrissä: 4,5 Hz , H-5) ja 8H 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), ja13C-NMR-spektri osoittaa neljän sp2-hiiliatomin läsnäolon.Amidiryhmän läsnäolo C2-asemassa arvioitiin HMBC-korrelaatiolla C-3-protonista amidikarbonyylihiileen δC:ssä 161,1.Lisäksi1H- ja13C NMR-huiput arvoilla 8H 4,10 (3H, S) ja 8C 68,3 osoittavat N-metoksiryhmien läsnäolon molekyylissä.Vaikka metoksiryhmän oikeaa sijaintia ei ollut vielä määritetty käyttämällä spektroskooppista analyysiä, kuten tehostettua erospektroskopiaa ja ydin-Overhauser-lyhennettä (NOEDF), N-metoksi-1H-pyrroli-2-karboksamidista tuli ensimmäinen ehdokasyhdiste.
Yhdisteen 1 oikean rakenteen määrittämiseksi suoritettiin kokonaissynteesi (kuvio 2a).Kaupallisesti saatavan 2-aminopyridiinin 2 käsittely m-CPBA:lla johti vastaavaan N-oksidiin 3 kvantitatiivisella saannolla.Yhdisteen 2 2-aminoatsidoinnin jälkeen suoritettiin Abramovichin kuvaama syklokondensaatioreaktio bentseenissä 90 °C:ssa, jolloin saatiin haluttu 1-hydroksi-1 H-pyrroli-2-karbonitriili 5 grammoina.Nopeus 60% (kaksi vaihetta).15,16.Yhdisteen 4 metylointi ja hydrolyysi tuotti sitten 1-metoksi-1 H-pyrroli-2-karboksyylihappoa (nimeltään "kumotonihappo", 6) hyvällä saannolla (70 %, kaksi vaihetta).Lopuksi amidointi happokloridivälituotteella 6 käyttäen vesipitoista ammoniakkia antoi Kumamoto-amidin 1 98 %:n saannolla.Kaikki syntetisoidun 1:n spektritiedot olivat samanlaisia kuin eristetyn 1:n, joten yhdisteen 1 rakenne määritettiin;
Urbenamidin ja urbeenihapon biologisen aktiivisuuden yleinen synteesi ja analyysi.(a) Kumamoto-amidin kokonaissynteesi.(b) Seitsemän päivän ikäisiä villityypin Arabidopsis Columbia (Col) -taimia kasvatettiin Murashige- ja Skoog (MS) -maljoilla, jotka sisälsivät kumomonamidia 6 tai koumamonamidia 1 osoitetuissa pitoisuuksissa.Mittakaava = 1 cm.
Ensin arvioimme urbenamidin ja sen välituotteiden biologisia aktiivisuuksia niiden kyvyn osalta moduloida kasvien kasvua.Lisäsimme erilaisia pitoisuuksia ursmonamidi 1:tä tai ursmonihappoa 6 MS-agar-elatusaineeseen ja viljelimme Arabidopsis thaliana -taimia tällä alustalla.Nämä määritykset osoittivat, että 6:n suuret pitoisuudet (500 µM) estivät juurien kasvua (kuvio 2b).Seuraavaksi generoimme erilaisia johdannaisia korvaamalla 6:n N1-asema ja suoritimme niille rakenne-aktiivisuussuhdetutkimuksia (analogisynteesiprosessi on kuvattu tukitiedoissa (SI)).Arabidopsis-taimia kasvatettiin alustalla, joka sisälsi 50 µM ursonihappojohdannaisia, ja juuren pituus mitattiin.kuten kuvassa näkyy.Kuten kuvioissa 3a, b ja S1 esitetään, koumamohapoilla on eripituisia lineaarisia alkoksiketjuja (9, 10, 11, 12 ja 13) tai suuria alkoksiketjuja (15, 16 ja 17) N1-asemassa.Johdannaiset osoittivat merkittävää juuren kasvun estoa.Lisäksi havaitsimme, että 200 µM 10, 11 tai 17 käyttö esti itämistä (kuvat 3c ja S2).
Kumamoto-amidin ja siihen liittyvien yhdisteiden rakenne-aktiivisuussuhteen tutkimus.(a) Analogien rakenne ja synteesikaavio.(b) MS-elatusaineella kasvatettujen 7 päivän ikäisten taimien juuren pituuden kvantifiointi 50 μM kumamonamidijohdannaisten kanssa tai ilman niitä.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja valehoidossa (t-testi, s< 0,05).n>18. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.nt tarkoittaa "ei testattu", koska yli 50 % siemenistä ei itänyt.(c) Käsiteltyjen siementen itämisnopeuden kvantifiointi, jota inkuboitiin 7 päivää MS-elatusaineessa 200 µM kumamonamidin ja vastaavien yhdisteiden kanssa tai ilman sitä.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja valekäsittelyssä (khin neliö-testi).n = 96.
Mielenkiintoista on, että C9:tä pidempien alkyylisivuketjujen lisääminen vähensi estävää aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että kumamotoiinihapon sukuiset yhdisteet tarvitsevat tietyn kokoisia sivuketjuja osoittaakseen biologista aktiivisuuttaan.
Koska rakenne-aktiivisuussuhdeanalyysi osoitti, että C9 oli muunnettu ursonihapoksi ja ursonihapon nonyylioksijohdannainen (jäljempänä KAND 11) oli tehokkain kasvin kasvun estäjä, teimme KAND 11:n yksityiskohtaisemman karakterisoinnin. Arabidopsiksen hoito 50 µM KAND 11 esti itämisen melkein kokonaan, kun taas pienemmät KAND 11:n pitoisuudet (40, 30, 20 tai 10 µM) estivät juurien kasvua annoksesta riippuvalla tavalla (kuvat 4a, b).Testataksemme, vaikuttaako KAND 11 juuren meristeemien elinkelpoisuuteen, tutkimme propidiumjodidilla (PI) värjättyjä juurimeristeemejä ja mittasimme meristeemialueen koon.25 μM KAND-11:tä sisältävällä alustalla kasvatettujen taimien meristeemin koko oli 151,1 ± 32,5 μm, kun taas DMSO:ta sisältävällä kontrollialustalla kasvatettujen taimien meristeemin koko oli 264,7 ± 30,8 μm, (kuva 4c) , mikä osoittaa, että KAND-11 palauttaa solutoiminnan.leviäminen.Juuren meristeemi.Tämän mukaisesti KAND 11 -käsittely vähensi solunjakautumismarkkerin CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signaalin määrää juurimeristeemissä (kuvio 4e)17.Nämä tulokset osoittavat, että KAND 11 estää juurikasvua vähentämällä solujen lisääntymisaktiivisuutta.
Urbenonihappojohdannaisten (urbenyylioksijohdannaisten) kasvua estävän vaikutuksen analyysi.(a) 7 päivän ikäiset villityypin Col-taimet, jotka on kasvatettu MS-maljoilla ilmoitetuilla KAND 11 -pitoisuuksilla. Mittaviiva = 1 cm.(b) Juuren pituuden kvantifiointi.Kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (Tukey HSD testi, s< 0,05).n>16. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD.(c) Konfokaalinen mikroskopia propidiumjodidilla värjätyistä villityypin Col-juurista, jotka on kasvatettu MS-maljoilla 25 µM KAND 11:n kanssa tai ilman sitä. Valkoiset hakasulkeet osoittavat juuren meristeemiä.Mittakaava = 100 µm.d) Juuren meristeemin koon kvantifiointi (n = 10-11).Tilastolliset erot määritettiin t-testillä (s< 0,05).Palkit edustavat keskimääräistä meristeemikokoa.(e) CDKB2-rakenteen sisältävän juurimeristeemin differentiaalinen interferenssikontrastimikroskopia (DIC);1pro: CDKB2;1-GUS värjättiin ja värjättiin 5 päivän ikäisillä taimilla, jotka on kasvatettu MS-maljoilla 25 uM KAND-määrityksellä tai ilman sitä.
KAND 11:n fytotoksisuutta testattiin edelleen käyttämällä toista kaksisirkkaista kasvia, tupakkaa (Nicotiana tabacum) ja suurta maakasvien malliorganismia, maksamatoa (Marchantia polymorpha).Kuten Arabidopsiksen tapauksessa, 25 µM KAND 11:tä sisältävällä alustalla kasvatetut tupakka-SR-1-taimet tuottivat lyhyempiä juuria (kuva 5a).Lisäksi 40 siemenestä 48 siemenestä itävät 200 μM KAND 11:tä sisältävillä maljoilla, kun taas kaikki 48 siementä itävät valekäsitellyllä alustalla, mikä osoittaa, että korkeammat KAND-pitoisuudet olivat merkittäviä (p< 0,05;chi testi -neliö) esti tupakan itämistä.(kuvio 5b).Lisäksi KAND 11:n pitoisuus, joka esti bakteerien kasvua maksamatossa, oli samanlainen kuin tehokas pitoisuus Arabidopsiksessa (kuvio 5c).Nämä tulokset osoittavat, että KAND 11 voi estää useiden kasvien kasvua.Sitten tutkimme karhun monoamidiin liittyvien yhdisteiden mahdollista sytotoksisuutta muissa organismeissa, nimittäin ihmisen HeLa-soluissa ja Escherichia coli -kannassa DH5α, korkeampien eläin- ja bakteerisolujen edustajina.Useissa solujen lisääntymismäärityksissä havaitsimme, että koumamonamidi 1, koumamonamidihappo 6 ja KAND 11 eivät vaikuttaneet HeLa- tai E. coli -solujen kasvuun pitoisuuksilla 100 µM (kuvio 5d, e).
KAND 11:n kasvun esto muissa kuin Arabidopsis-organismeissa.(a) Kahden viikon ikäisiä villityypin SR-1-tupakan taimia kasvatettiin pystysuoraan sijoitetuilla MS-maljoilla, jotka sisälsivät 25 µM KAND 11:tä. (b) Kahden viikon ikäisiä villityypin SR-1-tupakan taimia kasvatettiin vaakasuorassa asennossa. MS-maljat, jotka sisältävät 200 µM KAND 11:tä. (c) Gamborg B5 -maljoilla kasvatettuja kahden viikon ikäisiä villityypin Tak-1-maksajuuren silmuja ilmoitetuilla KAND 11 -pitoisuuksilla. Punaiset nuolet osoittavat itiöitä, jotka lopettivat kasvun kahden viikon inkubaation aikana. ajanjaksoa.(d) HeLa-solujen soluproliferaatiomääritys.Elävien solujen lukumäärä mitattiin kiintein aikavälein käyttämällä solulaskentasarjaa 8 (Dojindo).Kontrollina HeLa-soluja käsiteltiin 5 μg/ml aktinomysiini D:llä (Act D), joka estää RNA-polymeraasin transkriptiota ja aiheuttaa solukuoleman.Analyysit suoritettiin kolmena rinnakkaisena.(e) E. coli -soluproliferaatiomääritys.E. colin kasvu analysoitiin mittaamalla OD600.Kontrollina soluja käsiteltiin 50 μg/ml ampisilliinilla (Amp), joka estää bakteerien soluseinän synteesiä.Analyysit suoritettiin kolmena rinnakkaisena.
Selvittääksemme uramidiin liittyvien yhdisteiden aiheuttaman sytotoksisuuden vaikutusmekanismin analysoimme uudelleen urbeenihappojohdannaiset, joilla on kohtalaisia estäviä vaikutuksia.kuten kuvassa näkyy.Kuten kuvista 2b, 6a näkyy, suuria urmotonihappoa 6 sisältävillä agarmaljoilla (200 μM) kasvatetut taimet tuottivat lyhyempiä ja vasemmalle kaarevia juuria (θ = – 23,7 ± 6,1), kun taas kontrollialustalla kasvatetut taimet taimet tuottivat lähes suorat juuret (θ = – 3,8 ± 7,1).Tämän ominaisen vinon kasvun tiedetään johtuvan aivokuoren mikrotubulusten toimintahäiriöstä14,18.Tämän havainnon mukaisesti mikrotubuluksia epävakauttavat lääkkeet disopyramidi ja oryzaliini aiheuttivat samanlaisen juuren kallistumisen kasvuolosuhteissamme (kuvat 2b, 6a).Samalla testasimme urmotonihappojohdannaisia ja valitsimme niistä useita, jotka tietyissä pitoisuuksissa indusoivat vinojuuren kasvua.Yhdisteet 8, 9 ja 15 muuttivat juurikasvun suuntaa pitoisuuksilla 75 µM, 50 µM ja 40 µM, mikä osoittaa, että nämä yhdisteet voivat tehokkaasti destabiloida mikrotubuluksia (kuvio 2b, 6a).Testasimme myös tehokkainta ursolihappojohdannaista, KAND 11:tä, pienemmällä pitoisuudella (15 µM) ja havaitsimme, että KAND 11:n käyttö esti juurikasvua ja että juurikasvun suunta oli epätasainen, vaikka niillä oli taipumus kallistua vasemmalle ( Kuva C3)..Koska korkeammat pitoisuudet mikrotubuluksia epävakauttavia lääkkeitä joskus estävät kasvien kasvua pikemminkin kuin aiheuttavat juuren kallistumista, arvioimme myöhemmin mahdollisuuden, että KAND 11 vaikuttaa mikrotubuluksiin tarkkailemalla aivokuoren mikrotubuluksia juuren epidermaalisissa soluissa.Immunohistokemia käyttämällä anti-β-tubuliinivasta-aineita 25 µM KAND 11:llä käsiteltyjen taimijuurten epidermaalisissa soluissa osoitti lähes kaikkien aivokuoren mikrotubulusten katoamisen orvaskeden soluissa elongaatiovyöhykkeellä (kuva 6b).Nämä tulokset osoittavat, että kumamotonihappo ja sen johdannaiset vaikuttavat suoraan tai epäsuorasti mikrotubuluksiin hajottaen niitä ja että nämä yhdisteet ovat uusia mikrotubulusten estäjiä.
Ursonihappo ja sen johdannaiset muuttavat aivokuoren mikrotubuluksia Arabidopsis thalianassa.(a) Juuren kaltevuuskulma mitattuna erilaisten urmotonihappojohdannaisten läsnä ollessa ilmoitetuilla pitoisuuksilla.Kahden yhdisteen, joiden tiedettiin estävän mikrotubuluksia: disopyramidin ja orysaliinin, vaikutukset analysoitiin myös.Sisäpuolella näkyy juuren kasvukulman mittaamiseen käytetty standardi.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja valehoidossa (t-testi, s< 0,05).n>19. Mittakaava = 1 cm.(b) Kortikaaliset mikrotubulukset epidermaalisissa soluissa pidennysvyöhykkeellä.Mikrotubulukset villityypin Arabidopsis Col -juurissa, joita oli kasvatettu MS-levyillä 25 µM KAND 11:n kanssa tai ilman sitä, visualisoitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttämällä primäärisiä β-tubuliinivasta-aineita ja Alexa Fluor -konjugoituja sekundaarisia vasta-aineita.Mittakaavapalkki = 10 µm.(c) Juuren meristeemissä olevien mikrotubulusten mitoottinen rakenne.Mikrotubulukset visualisoitiin käyttämällä immunohistokemiallista värjäystä.Mitoottiset rakenteet, mukaan lukien profaasivyöhykkeet, karat ja phragmoplastit, laskettiin konfokaalisista kuvista.Nuolet osoittavat mitoottisia mikrotubulusrakenteita.Tähdet osoittavat merkittäviä eroja valehoidossa (t-testi, s< 0,05).n>9. Mittakaava = 50 µm.
Vaikka Ursalla on kyky häiritä mikrotubulusten toimintaa, sen vaikutusmekanismin odotetaan olevan erilainen kuin tyypillisten mikrotubulusten depolymerointiaineiden.Esimerkiksi korkeammat pitoisuudet mikrotubuluksia depolymeroivia aineita, kuten disopyramidia ja orytsaliinia, indusoivat epidermaalisten solujen anisotrooppista laajenemista, kun taas KAND 11 ei.Lisäksi KAND 11:n ja disopyramidin yhteiskäyttö johti yhdistettyyn disopyramidin aiheuttamaan juuren kasvuvasteeseen ja havaittiin KAND 11:n aiheuttama kasvun esto (kuva S4).Analysoimme myös yliherkän disopyramidi 1-1 (phs1-1) -mutantin vastetta KAND 11:lle. phs1-1:llä on ei-kanoninen tubuliinikinaasipistemutaatio ja se tuottaa lyhyempiä juuria, kun sitä käsitellään disopyramidilla9,20.KAND 11:tä sisältävällä agar-elatusaineella kasvatetuilla phs1-1-mutanttitaimilla oli lyhyemmät juuret, jotka olivat samanlaisia kuin disopyramidilla kasvatetuilla (kuva S5).
Lisäksi havaitsimme KAND 11:llä käsiteltyjen taimien juuren meristeemissä mitoottisia mikrotubulusrakenteita, kuten profaasivyöhykkeitä, karoja ja phragmoplasteja. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS:n havaintojen mukaisesti, merkittävä lasku havaittiin mitoottisten mikrotubulusten lukumäärä (kuvio .6c).
KAND 11:n sytotoksisuuden karakterisoimiseksi subsellulaarisessa resoluutiossa käsittelimme tupakka BY-2 -suspensiosoluja KAND 11:llä ja tarkkailimme niiden vastetta.Lisäsimme ensin KAND 11:n BY-2-soluihin, jotka ekspressoivat TagRFP-TUA6:ta, joka leimaa mikrotubulukset fluoresoivasti, arvioidaksemme KAND 11:n vaikutusta aivokuoren mikrotubuluksiin.Aivokuoren mikrotubulusten tiheys arvioitiin käyttämällä kuva-analyysiä, joka kvantifioi sytoskeletaalisten pikselien prosenttiosuuden sytoplasmisten pikseleiden joukossa.Määritystulokset osoittivat, että 1 tunnin käsittelyn jälkeen 50 µM tai 100 µM KAND 11:llä tiheys laski merkittävästi 0,94 ± 0,74 %:iin tai 0,23 ± 0,28 %:iin, kun taas DMSO:lla käsiteltyjen solujen tiheys oli 1,64 ± 0,61 ± 0,64 ± 0,28 %. % (kuvio 7a).Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia Arabidopsis-havainnon kanssa, jonka mukaan KAND 11 -käsittely indusoi aivokuoren mikrotubulusten depolymeroitumista (kuva 6b).Tutkimme myös BY-2-linjaa GFP-ABD-leimatuilla aktiinifilamenteilla käsittelyn jälkeen samalla KAND 11 -pitoisuudella ja havaitsimme, että KAND 11 -käsittely hajosi aktiinifilamentit.Käsittely 50 µM tai 100 µM KAND 11:llä yhden tunnin ajan vähensi aktiinifilamenttitiheyttä merkittävästi 1,20 ± 0,62 %:iin tai 0,61 ± 0,26 %:iin, kun taas tiheys DMSO:lla käsitellyissä soluissa oli 1,69 ± 0,51 % (F ig 0,51).7b).Nämä tulokset ovat ristiriidassa propytsamidin, joka ei vaikuta aktiinifilamentteihin, ja latrunkuliini B:n, aktiinin depolymeroijan, joka ei vaikuta mikrotubuluksiin (SI Kuva S6), vaikutuksiin.Lisäksi hoito koumamonamidi 1:llä, koumamonamidihapolla 6 tai KAND 11:llä ei vaikuttanut mikrotubuluksiin HeLa-soluissa (SI kuva S7).Siten KAND 11:n vaikutusmekanismin uskotaan olevan erilainen kuin tunnettujen sytoskeleton hajoajien.Lisäksi mikroskooppinen havainnointi KAND 11:llä käsitellyistä BY-2-soluista paljasti solukuoleman alkamisen KAND 11 -hoidon aikana ja osoitti, että Evansin sinisellä värjäytyneiden kuolleiden solujen osuus ei lisääntynyt merkittävästi 30 minuutin KAND 11 -hoidon jälkeen, kun taas 90 minuutin käsittelyn jälkeen 50 µM tai 100 µM KAND:lla kuolleiden solujen määrä kasvoi vastaavasti 43,7 %:iin tai 80,1 %:iin (kuvio 7c).Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että uusi ursolihappojohdannainen KAND 11 on kasvispesifinen sytoskeletaalin estäjä, jolla on aiemmin tuntematon vaikutusmekanismi.
KAND vaikuttaa aivokuoren mikrotubuluksiin, aktiinifilamentteihin ja tupakan BY-2-solujen elinkykyyn.(a) Kortikaalisten mikrotubulusten visualisointi BY-2-soluissa TagRFP-TUA6:n läsnä ollessa.KAND 11:llä (50 µM tai 100 µM) tai DMSO:lla käsitellyt BY-2-solut tutkittiin konfokaalimikroskopialla.Kortikaalisten mikrotubulusten tiheys laskettiin 25 itsenäisen solun mikrokuvista.Kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (Tukey HSD testi, s< 0,05).Mittakaavapalkki = 10 µm.(b) Kortikaaliset aktiinifilamentit BY-2-soluissa visualisoituina GFP-ABD2:n läsnä ollessa.KAND 11:llä (50 µM tai 100 µM) tai DMSO:lla käsitellyt BY-2-solut tutkittiin konfokaalimikroskopialla.Kortikaalisten aktiinifilamenttien tiheys laskettiin 25 itsenäisen solun mikrokuvista.Kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (Tukey HSD testi, s< 0,05).Mittakaavapalkki = 10 µm.(c) Kuolleiden BY-2-solujen tarkkailu Evansin sinisellä värjäyksellä.KAND 11:llä (50 µM tai 100 µM) tai DMSO:lla käsitellyt BY-2-solut tutkittiin kirkaskenttämikroskopialla.n = 3.Mittakaava = 100 µm.
Uusien luonnontuotteiden löytäminen ja soveltaminen on johtanut merkittäviin edistysaskeleihin ihmiselämän eri osa-alueilla, mukaan lukien lääketiede ja maatalous.Hyödyllisten yhdisteiden saamiseksi luonnonvaroista on tehty historiallista tutkimusta.Erityisesti aktinomykeettien tiedetään olevan käyttökelpoisia antiparasiittisina antibiootteina sukkulamadoille, koska ne pystyvät tuottamaan erilaisia sekundaarisia metaboliitteja, kuten avermektiiniä, ivermektiinin ja bleomysiinin johtoyhdistettä ja sen johdannaisia, joita käytetään lääketieteellisesti syövän vastaisena aineena21,22.Samoin aktinomykeeteista on löydetty erilaisia herbisidisiä yhdisteitä, joista osa on jo käytössä kaupallisesti1,23.Siksi aktinomykeettien metaboliittien analysointia haluttujen biologisten aktiivisuuksien omaavien luonnollisten tuotteiden eristämiseksi pidetään tehokkaana strategiana.Tässä tutkimuksessa löysimme uuden yhdisteen, koumamonamidin, S. werraensis -bakteerista ja syntetisoimme sen onnistuneesti.Ursonihappo on urbenamidin ja sen johdannaisten synteettinen välituote.Se voi aiheuttaa tyypillistä juurten käpristymistä, osoittaa kohtalaista tai voimakasta herbisidistä aktiivisuutta ja vahingoittaa suoraan tai epäsuorasti kasvien mikrotubuluksia.Urmotonihapon vaikutusmekanismi voi kuitenkin poiketa olemassa olevista mikrotubulusinhibiittoreista, koska KAND 11 hajottaa myös aktiinifilamentteja ja aiheuttaa solukuolemaa, mikä viittaa säätelymekanismiin, jolla urmotonihappo ja sen johdannaiset vaikuttavat moniin sytoskeletaalin rakenteisiin..
Urbenonihapon tarkempi karakterisointi auttaa ymmärtämään paremmin urbenonihapon vaikutusmekanismia.Erityisesti seuraava tavoite on arvioida ursonihapon kykyä sitoutua pelkistettyihin mikrotubuluksiin sen määrittämiseksi, vaikuttavatko ursonihappo ja sen johdannaiset suoraan mikrotubuluksiin ja depolymeroivatko ne, vai johtaako niiden toiminta mikrotubulusten destabiloitumiseen.Lisäksi siinä tapauksessa, että mikrotubulukset eivät ole suora kohde, ursonihapon vaikutuskohdan ja molekyylikohteiden tunnistaminen kasvisoluissa auttaa ymmärtämään paremmin läheisten yhdisteiden ominaisuuksia ja mahdollisia tapoja parantaa herbisidistä aktiivisuutta.Bioaktiivisuustestimme paljasti ursonihapon ainutlaatuisen sytotoksisen kyvyn kasvien, kuten Arabidopsis thalianan, tupakan ja maksamaton, kasvussa, kun taas E. coli- tai HeLa-solut eivät vaikuttaneet.Vähäinen tai ei lainkaan myrkyllisyyttä eläinsoluille on ursonihappojohdannaisten etu, jos ne kehitetään rikkakasvien torjunta-aineina käytettäväksi avoimilla maatalouspelloilla.Itse asiassa, koska mikrotubulukset ovat yleisiä rakenteita eukaryooteissa, niiden selektiivinen estäminen kasveissa on keskeinen vaatimus rikkakasvien torjunta-aineille.Esimerkiksi propytsamidia, mikrotubulusten depolymerointiainetta, joka sitoutuu suoraan tubuliiniin ja estää polymerisaatiota, käytetään rikkakasvien torjunta-aineena, koska se on alhainen toksisuus eläinsoluille24.Toisin kuin disopyramidilla, sukulaisbentsamidilla on erilaiset kohdespesifisyydet.Kasvien mikrotubulusten lisäksi RH-4032 tai bentsoksamidi estää myös eläinsolujen tai munamykeettien mikrotubuluksia, ja tsalilamidia käytetään fungisidina sen alhaisen fytotoksisuuden vuoksi25,26,27.Äskettäin löydetty karhu ja sen johdannaiset osoittavat selektiivistä sytotoksisuutta kasveja vastaan, mutta on syytä huomata, että lisämuutokset voivat muuttaa niiden kohdespesifisyyttä, mikä saattaa tarjota lisäjohdannaisia patogeenisten sienten tai munamykeettien torjuntaan.
Urbenonihapon ja sen johdannaisten ainutlaatuiset ominaisuudet ovat hyödyllisiä niiden kehittämisessä rikkakasvien torjunta-aineina ja tutkimusvälineinä.Sytoskeletonin merkitys kasvisolujen muodon säätelyssä tunnustetaan laajalti.Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvit ovat kehittäneet monimutkaisia mekanismeja aivokuoren mikrotubulusten järjestäytymiseen säätelemällä mikrotubulusten dynamiikkaa morfogeneesin hallitsemiseksi kunnolla.Suuri määrä mikrotubulusten aktiivisuuden säätelystä vastaavia molekyylejä on tunnistettu, ja niihin liittyvä tutkimus on edelleen käynnissä3,4,28.Nykyinen ymmärryksemme mikrotubulusten dynamiikasta kasvisoluissa ei täysin selitä aivokuoren mikrotubulusten organisoitumisen mekanismeja.Esimerkiksi vaikka sekä disopyramidi että orytsaliini voivat depolymeroida mikrotubuluksia, disopyramidi aiheuttaa vakavia juuren vääristymiä, kun taas orytsaliinilla on suhteellisen lievä vaikutus.Lisäksi mikrotubuluksia stabiloivassa tubuliinissa tapahtuvat mutaatiot aiheuttavat myös oikealle kiertoa juurissa, kun taas paklitakseli, joka myös stabiloi mikrotubulusten dynamiikkaa, ei.Siksi ursolihapon molekyylikohteiden tutkimisen ja tunnistamisen pitäisi tarjota uusia oivalluksia kasvien aivokuoren mikrotubulusten säätelyyn.Samoin tulevat vertailut kemikaaleista, jotka edistävät tehokkaasti vääristynyttä kasvua, kuten disopyramidi, ja vähemmän tehokkaita kemikaaleja, kuten oritsaliinia tai kumamotorihappoa, tarjoavat vihjeitä siitä, kuinka vääristynyt kasvu tapahtuu.
Toisaalta puolustukseen liittyvät solun luuston uudelleenjärjestelyt ovat toinen mahdollisuus selittää ursonihapon sytotoksisuutta.Patogeenin infektio tai elisitorin vieminen kasvisoluihin aiheuttaa joskus sytoskeleton tuhoutumisen ja sitä seuraavan solukuoleman29.Esimerkiksi munamykeetistä johdetun kryptoksantiinin on raportoitu hajottavan mikrotubuluksia ja aktiinifilamentteja ennen tupakkasolukuolemaa, samoin kuin KAND-käsittelyssä30,31.Puolustusvasteiden ja ursonihapon indusoimien soluvasteiden väliset yhtäläisyydet saimme meidät olettamaan, että ne laukaisevat yhteisiä soluprosesseja, vaikka ursonihapon nopeampi ja voimakkaampi vaikutus kuin kryptoksantiinilla on ilmeinen.Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että aktiinifilamenttien katkeaminen edistää spontaania solukuolemaa, johon ei aina liity mikrotubulusten hajoamista29.Lisäksi jää nähtäväksi, aiheuttaako taudinaiheuttaja tai herättäjä vääristynyttä juurikasvua, kuten ursonihappojohdannaiset tekevät.Siten puolustusvasteita ja sytoskeleton yhdistävä molekyylitieto on houkutteleva ongelma, joka on käsiteltävä.Ne voivat tarjota mahdollisuuksia kohdistaa tuntemattomiin solumekanismeihin hyödyntämällä ursonihappoon liittyvien pienimolekyylisten yhdisteiden läsnäoloa sekä erilaisia johdannaisia, joilla on vaihtelevat tehot.
Kaiken kaikkiaan uusien mikrotubulusten dynamiikkaa moduloivien yhdisteiden löytäminen ja soveltaminen tarjoaa tehokkaita menetelmiä kasvisolujen muodon määrityksen taustalla olevien monimutkaisten molekyylimekanismien käsittelemiseksi.Tässä yhteydessä äskettäin kehitetty yhdiste urmotonihappo, joka vaikuttaa mikrotubuluksiin ja aktiinifilamentteihin ja indusoi solukuolemaa, voi tarjota mahdollisuuden selvittää yhteys mikrotubulusten hallinnan ja näiden muiden mekanismien välillä.Siten kemiallinen ja biologinen analyysi urbenonihappoa käyttämällä auttaa meitä ymmärtämään molekyylin säätelymekanismeja, jotka ohjaavat kasvin sytoskeletoa.
Inokuloi S. werraensis MK493-CF1 500 ml:n erlenmeyerpulloon, joka sisältää 110 ml siemenelatusainetta, joka sisältää 2 % (w/v) galaktoosia, 2 % (w/v) Essence-tahnaa, 1 % (w/v) Bacto-koostumusta .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) maissiuutetta (KOGOSTCH Co., Ltd., Japani), 0,2 % (w/v) (NH4)2S04 ja 0,2 % CaC03 deionisoidussa vedessä.(pH 7,4 ennen sterilointia).Siemenviljelmiä inkuboitiin pyörivässä ravistelijassa (180 rpm) 27 °C:ssa 2 päivää.Tuotantoviljely kiinteässä olomuotokäymisessä.Siemenviljelmä (7 ml) siirrettiin 500 ml:n K-1-kolviin, joka sisälsi 40 g tuotantoalustaa, joka koostui 15 g:sta puristettua ohraa (MUSO Co., Ltd., Japani) ja 25 g:sta deionisoitua vettä (pH:ta ei säädetty). ennen sterilointia).).Fermentointi suoritettiin 30 °C:ssa pimeässä 14 päivän ajan.Fermentaatiomateriaali uutettiin 40 ml/pullo EtOH:lla ja sentrifugoitiin (1500 g, 4 °C, 10 min).Viljelmän supernatantti (60 ml) uutettiin 10 % MeOH/EtOAc-seoksella.Orgaaninen kerros haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin jäännös (59,5 mg), joka altistettiin HPLC:lle gradienttieluoimalla (0-10 minuuttia: 90 %) käänteisfaasikolonnilla (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × pituus 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuuttia: 90 % H2O/CH3CN - 70 % H2O/CH3CN (gradientti), 35–45 minuuttia: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minuuttia: 90 % H2O /EtOH 100 % EtOH:iin (gradientti (gradientti), 155-200 min: 100 % EtOH) virtausnopeudella 1,5 ml/min, kumamonamidi (1, 36,0 mg) eristettiin valkoisena amorfisena jauheena.
Kumamotoamidi (1);'H-NMR (500 MHz, CDC13) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1 H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1 H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1 H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ laskettu arvo: 141,0659, mitattu arvo: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm.
Columbian siemenet (Col-0) hankittiin Arabidopsis Biological Resource Centeristä (ABRC) luvalla tutkimuskäyttöön.Col-0-siemeniä lisättiin ja ylläpidettiin laboratorio-olosuhteissamme ja niitä käytettiin villityypin Arabidopsis-kasveina.Arabidopsiksen siemenet pintasteriloitiin ja viljeltiin puolivahvalla Murashige- ja Skoog-elatusaineella, joka sisälsi 2 % sakkaroosia (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (w/v) 2-(4-morfolino)etaanisulfonihappoa (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) ja 1,5 % agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C:ssa ja jatkuvassa valossa.Phs1-1-mutantin siemenet toimitti T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Kannan SR-1 siemenet toimitti T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ja niitä käytettiin villityypin tupakkakasveina.Tupakansiementen pinta steriloitiin ja liotettiin steriilissä vedessä kolmen yön ajan itämisen edistämiseksi, minkä jälkeen ne asetettiin puolivahvaan liuokseen, joka sisälsi 2 % sakkaroosia, 0,05 % (w/v) MES ja 0,8 % gellaanikumia (Fujifilm Wako Pure Chemical). Murashige.ja Skoog-elatusaine), jonka pH oli 5,7, ja inkuboitiin 23 °C:ssa jatkuvassa valossa.
Kannan Tak-1 toimitti T. Kohchi (Kioton yliopisto), ja sitä käytettiin standardikoeyksikkönä maksamatotutkimuksessa.Gemma saatiin steriloiduista viljellyistä kasveista ja maljattiin sitten Gamborg B5 -elatusaineelle (Fujifilm Wako Pure Chemical), joka sisälsi 1 % sakkaroosia ja 0,3 % gellaanikumia, ja inkuboitiin 23 °C:ssa jatkuvassa valossa.
Tobacco BY-2 -solut (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) toimitti S. Hasezawa (University of Tokyo).BY-2-solut laimennettiin 95-kertaisesti modifioituun Linsmeier- ja Skoog-elatusaineeseen ja täydennettiin viikoittain 2,4-dikloorifenoksietikkahapolla32.Solususpensiota sekoitettiin pyörivässä ravistelijassa nopeudella 130 rpm 27 °C:ssa pimeässä.Pese solut 10-kertaisella tilavuudella tuoretta alustaa ja suspendoi uudelleen samaan alustaan.Siirtogeeniset BY-2-solulinjat, jotka ekspressoivat stabiilisti mikrotubulusmarkkeria TagRFP-TUA6 tai aktiinifilamenttimarkkeria GFP-ABD2 kukkakaalin mosaiikkiviruksen 35S-promoottorin alla, luotiin kuten on kuvattu33,34,35.Näitä solulinjoja voidaan ylläpitää ja synkronoida käyttämällä menetelmiä, jotka ovat samanlaisia kuin alkuperäisessä BY-2-solulinjassa.
HeLa-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen alustassa (DMEM) (Life Technologies), jota oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia, 1,2 U/ml penisilliiniä ja 1,2 µg/ml streptomysiiniä 37°C:n inkubaattorissa, jossa oli 5 % CO2:ta.
Kaikki tässä käsikirjoituksessa kuvatut kokeet suoritettiin Japanin bioturvallisuusmääräysten ja -ohjeiden mukaisesti.
Yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kantaliuoksina ja laimennettiin MS-elatusaineeseen Arabidopsikselle ja tupakkaan tai Gamborg B5 -elatusaineelle maksamatolle.Juuren kasvun estomääritystä varten yli 10 siementä maljaa kohti kylvettiin agar-elatusaineelle, joka sisälsi osoitettuja yhdisteitä tai DMSO:ta.Siemeniä inkuboitiin kasvatuskammiossa 7 päivää.Taimet valokuvattiin ja juurien pituus mitattiin.Arabidopsis-idätysmääritystä varten 48 siementä maljaa kohti kylvettiin agar-elatusaineelle, joka sisälsi 200 µM yhdistettä tai DMSO:ta.Arabidopsis-siemeniä kasvatettiin kasvukammiossa ja itäneiden taimien lukumäärä laskettiin 7 päivää itämisen jälkeen (dag).Tupakan itävyysmääritystä varten 24 siementä maljaa kohti kylvettiin agar-elatusaineelle, joka sisälsi 200 µM KANDia tai DMSO:ta.Tupakansiemeniä kasvatettiin kasvatuskammiossa ja itäneiden taimien lukumäärä laskettiin 14 päivän kuluttua.Maksamahan kasvun estomääritystä varten 9 alkiota kustakin levystä maljattiin agar-elatusaineelle, joka sisälsi ilmoitetut KAND- tai DMSO-pitoisuudet, ja inkuboitiin kasvukammiossa 14 päivää.
Käytä 5 mg/ml propidiumjodidilla (PI) värjättyjä taimia juuren meristeemiorganisaation visualisoimiseksi.PI-signaalit tarkkailtiin fluoresenssimikroskopialla käyttämällä TCS SPE konfokaalista laserpyyhkäisymikroskooppia (Leica Microsystems).
Juurien histokemiallinen värjäys β-glukuronidaasilla (GUS) suoritettiin Malamin ja Benfeyn36 kuvaaman protokollan mukaisesti.Taimet kiinnitettiin 90-prosenttisessa asetonissa yön yli, värjättiin 0,5 mg/ml 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-p-d-glukuronihapolla GUS-puskurissa 1 tunnin ajan ja asetettiin hydratoituun kloraldehydiliuokseen.(8 g kloraalihydraattia, 2 ml vettä ja 1 ml glyserolia) ja tarkkailtiin differentiaaliinterferenssikontrastimikroskoopilla käyttäen Axio Imager M1 -mikroskooppia (Carl Zeiss).
Juurikulmat mitattiin 7 päivän ikäisistä taimista, jotka oli kasvatettu pystysuoraan sijoitetuilla lautasilla.Mittaa juuren kulma painovoimavektorin suunnasta vaiheessa 6 kuvatulla tavalla.
Aivokuoren mikrotubulusten järjestystä havaittiin kuvatulla tavalla, pienin muutoksin protokollaan 37 .Anti-β-tubuliinivasta-ainetta (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ja Alexa Fluor 488 -konjugoitua hiiren vastaista IgG:tä (Thermo Fisher Scientific: A32723) käytettiin primäärisinä ja sekundaarisina vasta-aineina laimennoksilla 1:1000 ja 1:100, vastaavasti.Fluoresenssikuvat saatiin käyttämällä TCS SPE konfokaalista laserpyyhkäisymikroskooppia (Leica Microsystems).Hanki Z-pinokuvat ja luo suurimman voimakkuuden projektiot valmistajan ohjeiden mukaan.
HeLa-soluproliferaatiomääritys suoritettiin käyttämällä Cell Counting Kit 8:aa (Dojindo) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
E. coli DH5a:n kasvu analysoitiin mittaamalla solutiheys viljelmässä käyttämällä spektrofotometriä 600 nm:ssä (OD600).
Sytoskeletaalista organisaatiota siirtogeenisissä BY-2-soluissa havaittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia, joka oli varustettu CSU-X1-konfokaaliskannauslaitteella (Yokogawa) ja sCMOS-kameralla (Zyla, Andor Technology).Sytoskeletaalisen tiheys arvioitiin kuva-analyysillä, joka kvantifioi sytoskeletaalisten pikselien prosenttiosuuden sytoplasmisten pikseleiden joukossa konfokaalisissa kuvissa käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa kuvatulla tavalla38, 39.
Solukuoleman havaitsemiseksi BY-2-soluissa alikvoottia solususpensiosta inkuboitiin 0,05 % Evans bluen kanssa 10 minuuttia huoneenlämpötilassa.Kuolleiden solujen selektiivinen Evans-sininen värjäytyminen riippuu väriaineen ekstruusiosta elävistä soluista koskemattoman plasmakalvon avulla40.Värjäytyneet solut tarkkailtiin käyttämällä kirkaskenttämikroskooppia (BX53, Olympus).
HeLa-soluja kasvatettiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10 % FBS:llä, kostutetussa inkubaattorissa 37 °C:ssa ja 5 % C02:ssa.Soluja käsiteltiin 100 µM KAND 11:llä, kumamonamiinihapolla 6, kumamonamidilla 1, 100 ng/ml kolsemidilla (Gibco) tai 100 ng/ml Nocodmazella (Sigma) 6 tunnin ajan 37 °C:ssa.Solut kiinnitettiin MetOH:lla 10 minuutin ajan ja sitten asetaatilla 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.Kiinnittyneitä soluja inkuboitiin p-tubuliinin primaarisen vasta-aineen (1D4A4, Proteintech: 66240-1) kanssa, joka oli laimennettu 0,5 % BSA/PBS:ään, 2 tuntia, pestiin 3 kertaa TBST:llä ja sitten inkuboitiin Alexa Fluor vuohen vasta-aineen kanssa.488 1 tunti.– Hiiren IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ja 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolia (DAPI) laimennettuna 0,5 % BSA/PBS:ään.Kolmen kerran TBST:llä pesun jälkeen värjäytyneet solut tarkkailtiin Nikon Eclipse Ti-E käänteismikroskoopilla.Kuvat otettiin jäähdytetyllä Hamamatsu ORCA-R2 CCD -kameralla käyttäen MetaMorph-ohjelmistoa (Molecular Devices).
Postitusaika: 17.6.2024