Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan tuloksen saavuttamiseksi suosittelemme, että käytät uudempaa selainversiota (tai poistat yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylittelyä tai JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Luonnontuotteiden löytäminen ja hyödyllinen käyttö voi auttaa parantamaan ihmisten elämää. Kasvien kasvua estäviä kemikaaleja käytetään laajalti rikkakasvien torjunta-aineina rikkakasvien torjunta-aineina. Koska tarvitaan erilaisia rikkakasvien torjunta-aineita, on tarpeen tunnistaa yhdisteitä, joilla on uusia vaikutusmekanismeja. Tässä tutkimuksessa löysimme uuden N-alkoksipyrroliyhdisteen, kumamoninamidin, Streptomyces werraensis MK493-CF1 -sienestä ja määritimme täydellisen synteesiprosessin. Biologisen aktiivisuuden määritysten avulla havaitsimme, että urs-monoamiinihappo on urs-monoamidin synteettinen välituote ja mahdollinen...kasvien kasvun estäjäLisäksi olemme kehittäneet erilaisia urbenonihappojohdannaisia, mukaan lukien urbenyylioksijohdannaisen (UDA), jolla on korkea rikkakasvien torjunta-aine vaikuttamatta negatiivisesti HeLa-solujen kasvuun. Havaitsimme myös, että urmotonihappojohdannaiset häiritsevät kasvien mikrotubuluksia; lisäksi KAND vaikuttaa aktiinifilamentteihin ja indusoi solukuolemaa; Nämä monitahoiset vaikutukset eroavat tunnettujen mikrotubulusten estäjien vaikutuksista ja viittaavat uuteen vaikutusmekanismiin ursonihapolle, mikä on tärkeä etu uusien rikkakasvien torjunta-aineiden kehittämisessä.
Hyödyllisten luonnontuotteiden ja niiden johdannaisten löytäminen ja käytännön soveltaminen on keino parantaa ihmisen elämänlaatua. Mikro-organismien, kasvien ja hyönteisten tuottamat toissijaiset metaboliitit ovat johtaneet merkittäviin edistysaskeliin lääketieteessä ja maataloudessa. Luonnontuotteista on kehitetty monia antibiootteja ja leukemialääkkeitä. Lisäksi erilaisiatorjunta-aineetNäistä luonnontuotteista uutetaan maataloudessa käytettäviä sienitautien ja rikkakasvien torjunta-aineita. Erityisesti rikkakasvien torjunta-aineet ovat tärkeitä työkaluja satojen lisäämiseksi nykyaikaisessa maataloudessa, ja erityyppisiä yhdisteitä käytetään jo kaupallisesti. Useita kasvien soluprosesseja, kuten fotosynteesi, aminohappojen aineenvaihdunta, soluseinän synteesi, mitoosin säätely, kasvihormonisignalointi tai proteiinisynteesi, pidetään tyypillisinä rikkakasvien torjunta-aineiden kohteina. Mikrotubulusten toimintaa estävät yhdisteet ovat yleinen rikkakasvien torjunta-aineiden luokka, jotka vaikuttavat kasvien kasvuun vaikuttamalla mitoosin säätelyyn.
Mikrotubulukset ovat sytoskeletonin osia ja ne ovat laajalti säilyneet eukaryoottisoluissa. Tubuliiniheterodimeeri koostuu α-tubuliinista ja β-tubuliinista muodostaen lineaarisia mikrotubulusprotofilamentteja, joista 13 muodostaa sylinterimäisen rakenteen. Mikrotubuluksilla on useita rooleja kasvisoluissa, mukaan lukien solun muodon, solujen jakautumisen ja solunsisäisen kuljetuksen määrittäminen3,4. Kasvisolut sisältävät mikrotubuluksia interfaasiplasmakalvon alla, ja näiden niin kutsuttujen kortikaalisten mikrotubulusten uskotaan kontrolloivan selluloosamikrofibrillien organisoitumista selluloosa-syntaasikompleksien säätelyn kautta4,5. Juuren epidermisolujen kortikaaliset mikrotubulukset, jotka sijaitsevat juuren kärjen nopean pidentymisen alueella, sijaitsevat sivusuunnassa, ja selluloosamikrokuidut seuraavat näitä mikrotubuluksia ja rajoittavat solujen laajenemisen suuntaa edistäen siten anisotrooppista solujen pidentymistä. Siksi mikrotubulusten toiminta liittyy läheisesti kasvin morfologiaan. Aminohapposubstituutiot tubuliinia koodaavissa geeneissä aiheuttavat kortikaalisten mikrotubulusryhmien vinoutumista ja vasemman- tai oikeanpuoleista kasvua Arabidopsis-kasvissa 6,7. Samoin mutaatiot mikrotubuluksiin liittyvissä proteiineissa, jotka säätelevät mikrotubulusten dynamiikkaa, voivat myös johtaa vääristyneeseen juurien kasvuun8,9,10,11,12,13. Lisäksi käsittely mikrotubuluksia häiritsevillä rikkakasvien torjunta-aineilla, kuten disopyramidilla, joka tunnetaan myös nimellä pretilakloori, aiheuttaa myös vasemmanpuoleista vinoa juurien kasvua14. Nämä tiedot osoittavat, että mikrotubulusten toiminnan tarkka säätely on ratkaisevan tärkeää kasvien kasvusuunnan määrittämiseksi.
Erilaisia mikrotubulusten estäjiä on löydetty, ja nämä lääkkeet ovat antaneet merkittävän panoksen sytoskeletaalitutkimukseen sekä maatalouteen ja lääketieteeseen2. Erityisesti orytsaliini, dinitroaniliiniyhdisteet, disopyramidi, bentsamidin kaltaiset yhdisteet ja niiden analogit voivat estää mikrotubulusten toimintaa ja siten estää kasvien kasvua. Siksi niitä käytetään laajalti rikkakasvien torjunta-aineina. Koska mikrotubulukset ovat kuitenkin tärkeä osa kasvi- ja eläinsoluja, useimmat mikrotubulusten estäjät ovat sytotoksisia molemmille solutyypeille. Siksi, vaikka niiden tunnustettua hyödyllisyyttä rikkakasvien torjunta-aineina käytetään, käytännön tarkoituksiin käytetään vain rajoitettua määrää mikrotubulusten vastaisia aineita.
Streptomyces on Streptomyces-heimon suku, johon kuuluu aerobisia, grampositiivisia ja rihmamaisia bakteereja, ja se tunnetaan laajalti kyvystään tuottaa monenlaisia sekundaarisia metaboliitteja. Siksi sitä pidetään yhtenä tärkeimmistä uusien biologisesti aktiivisten luonnontuotteiden lähteistä. Tässä tutkimuksessa löysimme uuden yhdisteen nimeltä kumamoninamidi, joka eristettiin Streptomyces werraensis MK493-CF1- ja S. werraensis ISP 5486 -bakteereista. Spektrianalyysin ja täyden spektrianalyysin avulla kumamoninamidin rakenne karakterisoitiin ja sen ainutlaatuinen N-alkoksipyrrolirunko määritettiin. Ursmonihapon, ursmonoamidin ja sen johdannaisten synteettisen välituotteen, havaittiin estävän suositun mallikasvin Arabidopsis thaliana kasvua ja itämistä. Rakenne-aktiivisuussuhdetta koskevassa tutkimuksessa havaitsimme, että yhdiste, jonka C9 on modifioitu ursonihapoksi, jota kutsutaan ursonihapon nonyylioksijohdannaiseksi (KAND), tehostaa merkittävästi ursonihapon kasvua ja itämistä estävää vaikutusta. Merkillepantavaa on, että äskettäin löydetty kasvinkasvun estäjä vaikutti myös tupakan ja maksasadan kasvuun eikä ollut sytotoksinen bakteereille tai HeLa-soluille. Lisäksi jotkut urmotonihappojohdannaiset aiheuttavat vääristyneen juurifenotyypin, mikä viittaa siihen, että nämä johdannaiset vaikuttavat suoraan tai epäsuorasti mikrotubuluksiin. Tämän ajatuksen mukaisesti havaintomme joko immunohistokemiallisesti tai fluoresoivilla proteiineilla leimatuista mikrotubuluksista osoittavat, että KAND-käsittely depolymeroi mikrotubuluksia. Lisäksi käsittely kumamotonihappojohdannaisilla hajotti aktiinimikrofilamentteja. Näin ollen olemme löytäneet uuden kasvinkasvun estäjän, jonka ainutlaatuiseen vaikutusmekanismiin kuuluu sytoskeletonin tuhoutuminen.
Kanta MK493-CF1 eristettiin maaperästä Shinagawa-kussa, Tokiossa. Kanta MK493-CF1 muodosti hyvin haaroittunutta stroomarihmastoa. 16S ribosomaalisen RNA-geenin osittainen sekvenssi (1422 bp) määritettiin. Tämä kanta on hyvin samankaltainen kuin S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tyypillinen kanta, 99,93 %). Tämän tuloksen perusteella määritettiin, että tämä kanta oli läheistä sukua S. werraensiksen tyyppikannalle. Siksi nimesimme kannan alustavasti S. werraensis MK493-CF1. Myös S. werraensis ISP 5486T tuottaa samoja bioaktiivisia yhdisteitä. Koska luonnontuotteiden saamista tästä mikro-organismista oli aiemmin tutkittu vain vähän, tehtiin lisäkemiallista tutkimusta. Kun S. werraensis MK493-CF1 -kantaa oli viljelty ohra-alustalla kiinteän olomuodon käymisellä 30 °C:ssa 14 päivän ajan, alusta uutettiin 50-prosenttisella etanolilla. 60 ml näytettä kuivattiin, jolloin saatiin 59,5 mg raakauutetta. Raakauute analysoitiin käänteisfaasi-HPLC:llä, jolloin saatiin N-metoksi-1H-pyrroli-2-karboksamidia (1, nimeltään kumamoninamidi, 36,0 mg). Yhdisteen 1 kokonaismäärä on noin 60 % raakauutteesta. Siksi päätimme tutkia yksityiskohtaisesti kumamotoamidi 1:n ominaisuuksia.
Kumamonamidi 1 on valkoinen amorfinen jauhe, ja korkean erotuskyvyn massaspektrometria (HRESIMS) vahvistaa C6H8N2O2:n (kuva 1). Tämän yhdisteen C2-substituoidulle pyrrolifragmentille on tunnusomaista δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H NMR -spektrissä: 4,5 Hz, H-5) ja δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), ja 13C NMR -spektri osoittaa neljän sp2-hiiliatomin läsnäolon. Amidiryhmän läsnäolo C2-asemassa arvioitiin HMBC-korrelaatiolla C-3-protonista amidikarbonyylihiileen kohdassa δC 161,1. Lisäksi 1H- ja 13C-NMR-piikit kohdissa δH 4,10 (3H, S) ja δC 68,3 osoittavat N-metoksiryhmien läsnäolon molekyylissä. Vaikka metoksiryhmän oikeaa sijaintia ei ollut vielä määritetty spektroskooppisella analyysillä, kuten tehostetulla differenssispektroskopialla ja ydin-Overhauser-lyhenteellä (NOEDF), N-metoksi-1H-pyrroli-2-karboksamidista tuli ensimmäinen ehdokasyhdiste.
Yhdisteen 1 oikean rakenteen määrittämiseksi suoritettiin täyssynteesi (kuva 2a). Kaupallisesti saatavilla olevan 2-aminopyridiinin 2 käsittely m-CPBA:lla johti vastaavaan N-oksidiin 3 kvantitatiivisella saannolla. Yhdisteen 2 2-aminoatsidoinnin jälkeen suoritettiin Abramovitšin kuvaama syklokondensaatioreaktio bentseenissä 90 °C:ssa, jolloin saatiin haluttu 1-hydroksi-1H-pyrroli-2-karbonitriili 5 grammoina. Nopeus 60 % (kaksi vaihetta). 15,16. Yhdisteen 4 metylointi ja hydrolyysi antoivat sitten 1-metoksi-1H-pyrroli-2-karboksyylihappoa (kutsutaan "kumotonihapoksi", 6) hyvällä saannolla (70 %, kaksi vaihetta). Lopuksi amidointi happokloridivälituotteen 6 kautta vesipitoisella ammoniakilla antoi Kumamoton amidin 1 98 %:n saannolla. Kaikki syntetisoidun yhdisteen 1 spektritiedot olivat samankaltaisia kuin eristetyn yhdisteen 1, joten yhdisteen 1 rakenne määritettiin;
Urbenamidin ja urbeenihapon yleinen synteesi ja biologisen aktiivisuuden analyysi. (a) Kumamoton amidin kokonaissynteesi. (b) Seitsemän päivän ikäisiä villityypin Arabidopsis Columbia (Col) -taimia kasvatettiin Murashige- ja Skoog (MS) -maljoilla, jotka sisälsivät kumamoninamidi 6:ta tai kumamoninamidi 1:tä ilmoitettuina pitoisuuksina. Skaala = 1 cm.
Ensin arvioimme urbenamidin ja sen välituotteiden biologisia vaikutuksia kasvien kasvun säätelyyn. Lisäsimme MS-agar-agariin eri pitoisuuksina ursmonamidi 1:tä tai ursmonihappoa 6 ja viljelimme Arabidopsis thaliana -taimia tällä alustalla. Nämä määritykset osoittivat, että suuret pitoisuudet (500 μM) 6:ta estivät juurien kasvua (kuva 2b). Seuraavaksi loimme erilaisia johdannaisia korvaamalla yhdisteen 6 N1-aseman ja suoritimme niillä rakenne-aktiivisuussuhdetutkimuksia (analogien synteesiprosessi on kuvattu lisätiedoissa (SI)). Arabidopsis-taimia kasvatettiin alustalla, joka sisälsi 50 μM ursonihappojohdannaisia, ja juurien pituus mitattiin, kuten kuvassa näkyy. Kuten kuvissa 3a, b ja S1 on esitetty, kumaamihapoilla on eri pituisia lineaarisia alkoksiketjuja (9, 10, 11, 12 ja 13) tai pitkiä alkoksiketjuja (15, 16 ja 17) N1-asemassa. Johdannaiset osoittivat merkittävää juurien kasvun estymistä. Lisäksi havaitsimme, että 200 μM:n yhdisteiden 10, 11 tai 17 käyttö esti itämistä (kuvat 3c ja S2).
Kumamoton amidin ja siihen liittyvien yhdisteiden rakenne-aktiivisuussuhteen tutkimus. (a) Analogien rakenne ja synteesikaavio. (b) 7 päivän ikäisten taimien juuren pituuden kvantifiointi MS-elatusaineella, jossa oli tai ei ollut 50 μM kumamoninamidijohdannaisia. Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja lumekäsittelyyn verrattuna (t-testi, p< 0,05). n>18. Tiedot on esitetty keskiarvona ± keskihajonta. nt tarkoittaa "ei testattu", koska yli 50 % siemenistä ei itänyt. (c) Käsiteltyjen siementen itämisnopeuden kvantifiointi, kun siemeniä inkuboitiin 7 päivää MS-elatusaineessa, jossa oli tai ei ollut 200 μM kumamonaamidia ja vastaavia yhdisteitä. Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja lumekäsittelyyn verrattuna (khiin neliö -testi). n = 96.
Mielenkiintoista on, että C9:ää pidempien alkyylisivuketjujen lisääminen vähensi estävää aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että kumamotoiinihappoon liittyvät yhdisteet tarvitsevat tietyn kokoisia sivuketjuja biologisen aktiivisuutensa osoittamiseksi.
Koska rakenne-aktiivisuussuhdeanalyysi osoitti, että C9 oli modifioitu ursonihapoksi ja ursonihapon nonyylioksijohdannainen (jäljempänä KAND 11) oli tehokkain kasvien kasvun estäjä, teimme KAND 11:lle yksityiskohtaisemman karakterisoinnin. Arabidopsis-käsittely 50 μM KAND 11:llä esti itämisen lähes kokonaan, kun taas pienemmät KAND 11 -pitoisuudet (40, 30, 20 tai 10 μM) estivät juurien kasvua annoksesta riippuvalla tavalla (kuva 4a, b). Testataksemme, vaikuttaako KAND 11 juurimeristeemin elinkykyyn, tutkimme propidiumjodidilla (PI) värjättyjä juurimeristeemejä ja mittasimme meristeemin pinta-alan koon. 25 μM KAND-11:tä sisältävällä kasvualustalla kasvatettujen taimien meristeemin koko oli 151,1 ± 32,5 μm, kun taas DMSO:ta sisältävällä kontrollikasvualustalla kasvatettujen taimien meristeemin koko oli 264,7 ± 30,8 μm (kuva 4c, d), mikä osoittaa, että KAND-11 palauttaa soluaktiivisuuden. leviäminen. Juuren meristeemi. Tämän mukaisesti KAND 11 -käsittely vähensi solunjakautumismarkkerin CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signaalin määrää juurimeristeemissä (kuva 4e) 17. Nämä tulokset osoittavat, että KAND 11 estää juurien kasvua vähentämällä solujen lisääntymisaktiivisuutta.
Urbenonihappojohdannaisten (urbenyylioksijohdannaisten) kasvua estävän vaikutuksen analyysi. (a) 7 päivän ikäisiä villityypin Col-taimi kasvatettuna MS-maljoilla ilmoitetuilla KAND 11 -pitoisuuksilla. Skaalapalkki = 1 cm. (b) Juuren pituuden kvantifiointi. Kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (Tukey HSD -testi, p< 0,05). n>16. Tiedot on esitetty keskiarvona ± keskihajonta. (c) Propidiumjodidilla värjättyjen villityypin Col-juurien konfokaalimikroskopia, jota on kasvatettu MS-levyillä 25 μM KAND 11:n kanssa tai ilman sitä. Valkoiset sulkeet osoittavat juurimeristeemiä. Skaalapalkki = 100 µm. (d) Juurimeristeemin koon kvantifiointi (n = 10–11). Tilastolliset erot määritettiin t-testillä (p< 0,05). Pylväät edustavat meristeemin keskimääräistä kokoa. (e) CDKB2-konstruktin sisältävän juurimeristeemin differentiaalinen interferenssikontrastimikroskopia (DIC); 1pro: CDKB2; 1-GUS-värjäys ja värjäys 5 päivän ikäisillä taimilla, joita kasvatettiin MS-levyillä 25 µM KAND-määrityksellä tai ilman sitä.
KAND 11:n fytotoksisuutta testattiin edelleen käyttämällä toista kaksisirkkaista kasvia, tupakkaa (Nicotiana tabacum), ja tärkeää maakasvimalliorganismia, maksasammalta (Marchantia polymorpha). Kuten Arabidopsis-lajin tapauksessa, 25 μM KAND 11:tä sisältävällä alustalla kasvatetut tupakan SR-1-taimet tuottivat lyhyempiä juuria (kuva 5a). Lisäksi 40/48 siementä iti maljoilla, jotka sisälsivät 200 μM KAND 11:tä, kun taas kaikki 48 siementä itivät kontrollikäsitellyllä alustalla, mikä osoittaa, että korkeammat KAND-pitoisuudet olivat merkittäviä (p< 0,05; khiin neliö) esti tupakan itämistä. (Kuva 5b). Lisäksi KAND 11:n pitoisuus, joka esti bakteerien kasvua maksasadassa, oli samanlainen kuin tehokas pitoisuus Arabidopsisissa (Kuva 5c). Nämä tulokset osoittavat, että KAND 11 voi estää useiden kasvien kasvua. Sitten tutkimme karhun monoamidiin liittyvien yhdisteiden mahdollista sytotoksisuutta muissa organismeissa, nimittäin ihmisen HeLa-soluissa ja Escherichia coli DH5α -kannassa, jotka edustavat vastaavasti korkeampia eläin- ja bakteerisoluja. Sarjassa soluproliferaatiomäärityksiä havaitsimme, että kumamonamidi 1, kumamonamidihappo 6 ja KAND 11 eivät vaikuttaneet HeLa- tai E. coli -solujen kasvuun 100 μM:n pitoisuuksina (Kuva 5d, e).
KAND 11:n kasvun estyminen muissa kuin Arabidopsis-organismeissa. (a) Kaksi viikkoa vanhoja villityypin SR-1-tupakan taimia kasvatettiin pystysuoraan sijoitetuilla MS-levyillä, jotka sisälsivät 25 μM KAND 11:tä. (b) Kaksi viikkoa vanhoja villityypin SR-1-tupakan taimia kasvatettiin vaakasuoraan sijoitetuilla MS-levyillä, jotka sisälsivät 200 μM KAND 11:tä. (c) Kaksi viikkoa vanhoja villityypin Tak-1-maksayrtin silmuja kasvatettiin Gamborg B5 -levyillä ilmoitetuilla KAND 11 -pitoisuuksilla. Punaiset nuolet osoittavat itiöitä, jotka lakkasivat kasvamasta kahden viikon inkubointijakson aikana. (d) HeLa-solujen proliferaatiomääritys. Elinkelpoisten solujen lukumäärä mitattiin kiintein aikavälein käyttämällä solujen laskentapakkausta 8 (Dojindo). Kontrollina HeLa-soluja käsiteltiin 5 μg/ml aktinomysiini D:llä (Act D), joka estää RNA-polymeraasin transkriptiota ja aiheuttaa solukuoleman. Analyysit tehtiin kolmena rinnakkaismäärityksenä. (e) E. coli -solujen proliferaatiomääritys. E. colin kasvua analysoitiin mittaamalla OD600. Kontrollina soluja käsiteltiin 50 μg/ml ampisilliinilla (Amp), joka estää bakteerien soluseinän synteesiä. Analyysit tehtiin kolmena rinnakkaismäärityksenä.
Selvittääksemme uramidin kaltaisten yhdisteiden aiheuttaman sytotoksisuuden vaikutusmekanismin analysoimme uudelleen kohtalaisen estävän vaikutuksen omaavia urbeenihappojohdannaisia, kuten kuvasta näkyy. Kuten kuvista 2b ja 6a käy ilmi, korkeita pitoisuuksia (200 μM) urmotonihappoa 6 sisältävillä agarlevyillä kasvatetut taimet tuottivat lyhyempiä ja vasemmalle kaarevia juuria (θ = –23,7 ± 6,1), kun taas kontrollialustalla kasvatettujen taimien juuret olivat lähes suorat (θ = –3,8 ± 7,1). Tämän ominaisen vinon kasvun tiedetään johtuvan kortikaalisten mikrotubulusten toimintahäiriöstä14,18. Tämän havainnon mukaisesti mikrotubuluksia destabiloivat lääkkeet disopyramidi ja orytsaliini aiheuttivat samanlaista juurien kallistumista kasvuolosuhteissamme (kuvat 2b ja 6a). Samanaikaisesti testasimme urmotonihappojohdannaisia ja valitsimme niistä useita, jotka tietyillä pitoisuuksilla aiheuttivat vinon juurien kasvua. Yhdisteet 8, 9 ja 15 muuttivat juuren kasvusuuntaa pitoisuuksilla 75 μM, 50 μM ja 40 μM, mikä osoittaa, että nämä yhdisteet voivat tehokkaasti destabiloida mikrotubuluksia (kuva 2b, 6a). Testasimme myös tehokkainta ursolihappojohdannaista, KAND 11:tä, pienemmällä pitoisuudella (15 µM) ja havaitsimme, että KAND 11:n käyttö esti juurien kasvua ja että juurien kasvusuunta oli epätasainen, vaikkakin ne pyrkivät viettämään vasemmalle (kuva C3). Koska mikrotubuluksia destabiloivien lääkeaineiden suuremmat pitoisuudet joskus estävät kasvien kasvua sen sijaan, että aiheuttaisivat juurien kallistumista, arvioimme myöhemmin mahdollisuutta, että KAND 11 vaikuttaa mikrotubuluksiin havaitsemalla kortikaalisia mikrotubuluksia juuren epidermisoluissa. Immunohistokemia käyttämällä anti-β-tubuliini-vasta-aineita taimien juurien epidermisoluissa, joita käsiteltiin 25 μM KAND 11:llä, osoitti lähes kaikkien kortikaalisten mikrotubulusten katoamisen epidermisoluista elongaatiovyöhykkeellä (kuva 6b). Nämä tulokset osoittavat, että kumamotonihappo ja sen johdannaiset vaikuttavat suoraan tai epäsuorasti mikrotubuluksiin häiriten niitä ja että nämä yhdisteet ovat uusia mikrotubulusten estäjiä.
Ursonihappo ja sen johdannaiset muuttavat Arabidopsis thalianan kortikaalisia mikrotubuluksia. (a) Juuren kaltevuuskulma mitattuna erilaisten urmotonihappojohdannaisten läsnä ollessa ilmoitetuilla pitoisuuksilla. Analysoitiin myös kahden mikrotubuluksia estävän yhdisteen, disopyramidin ja oryzaliinin, vaikutuksia. Kuvassa näkyy standardi, jota käytettiin juuren kasvukulman mittaamiseen. Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja lumekäsittelyyn verrattuna (t-testi, p< 0,05). n>19. Skaalapalkki = 1 cm. (b) Kortikaaliset mikrotubulukset epidermisoluissa elongaatiovyöhykkeellä. Villityypin Arabidopsis Col -juurien mikrotubulukset, joita kasvatettiin MS-levyillä 25 μM KAND 11:n kanssa tai ilman, visualisoitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttäen β-tubuliini-primaarisia vasta-aineita ja Alexa Fluor -konjugoituja sekundaarisia vasta-aineita. Skaalapalkki = 10 µm. (c) Mikrotubulusten mitoottinen rakenne juuren meristeemissä. Mikrotubulukset visualisoitiin immunohistokemiallisella värjäyksellä. Mitoottiset rakenteet, mukaan lukien profaasivyöhykkeet, kardaanit ja fragmoplastit, laskettiin konfokaalikuvista. Nuolet osoittavat mitoottisten mikrotubulusten rakenteita. Asteriskit osoittavat merkittäviä eroja lumekäsittelyyn verrattuna (t-testi, p-arvo< 0,05). n>9. Skaalapalkki = 50 µm.
Vaikka Ursalla on kyky häiritä mikrotubulusten toimintaa, sen vaikutusmekanismin odotetaan olevan erilainen kuin tyypillisillä mikrotubulusten depolymerointiaineilla. Esimerkiksi suuremmat pitoisuudet mikrotubulusten depolymerointiaineita, kuten disopyramidi ja orytsaliini, indusoivat epidermisolujen anisotrooppista laajenemista, kun taas KAND 11 ei tee niin. Lisäksi KAND 11:n ja disopyramidin samanaikainen käyttö johti disopyramidin indusoimaan juurien kasvuvasteeseen ja havaittiin KAND 11:n indusoima kasvun estyminen (kuva S4). Analysoimme myös yliherkän disopyramidi 1-1 (phs1-1) -mutantin vastetta KAND 11:lle. phs1-1:llä on ei-kanoninen tubuliinikinaasipistemutaatio ja se tuottaa lyhyempiä juuria, kun sitä käsitellään disopyramidilla9,20. KAND 11:tä sisältävällä agar-alustalla kasvatettujen phs1-1-mutanttien taimien juuret olivat lyhyemmät, samankaltaiset kuin disopyramidilla kasvatetuilla taimilla (kuva S5).
Lisäksi havaitsimme KAND 11:llä käsiteltyjen taimien juurimeristeemissä mitoottisia mikrotubulusrakenteita, kuten profaasivyöhykkeitä, tumasukkuja ja frammoplasteja. Yhdenmukaisesti CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS:n havaintojen kanssa havaittiin merkittävä mitoottisten mikrotubulusten määrän väheneminen (kuva 6c).
KAND 11:n sytotoksisuuden karakterisoimiseksi subsellulaarisella resoluutiolla käsittelimme tupakkakasvien BY-2-suspensiosoluja KAND 11:llä ja tarkkailimme niiden vastetta. Lisäsimme ensin KAND 11:tä BY-2-soluihin, jotka ilmensivät TagRFP-TUA6:ta, joka leimaa fluoresoivasti mikrotubuluksia, arvioidaksemme KAND 11:n vaikutusta aivokuoren mikrotubuluksiin. Aivokuoren mikrotubulusten tiheys arvioitiin kuva-analyysillä, jossa kvantifioitiin sytoskeletaalisten pikseleiden prosenttiosuus sytoplasmisista pikseleistä. Määritystulokset osoittivat, että 50 μM:n tai 100 μM:n KAND 11 -käsittelyn jälkeen yhden tunnin ajan tiheys laski merkittävästi 0,94 ± 0,74 %:iin tai 0,23 ± 0,28 %:iin, kun taas DMSO:lla käsiteltyjen solujen tiheys oli 1,61 ± 0,34 % (kuva 7a). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia Arabidopsis-lehdessä tehdyn havainnon kanssa, jonka mukaan KAND 11 -käsittely indusoi aivokuoren mikrotubulusten depolymeroitumista (kuva 6b). Tutkimme myös BY-2-solulinjaa GFP-ABD-leimattujen aktiinifilamenttien kanssa käsittelyn jälkeen samalla KAND 11 -pitoisuudella ja havaitsimme, että KAND 11 -käsittely hajotti aktiinifilamentteja. Käsittely 50 μM:lla tai 100 μM:lla KAND 11:tä yhden tunnin ajan vähensi merkittävästi aktiinifilamenttien tiheyttä vastaavasti 1,20 ± 0,62 %:iin tai 0,61 ± 0,26 %:iin, kun taas DMSO-käsitellyissä soluissa tiheys oli 1,69 ± 0,51 % (kuva 2). 7b). Nämä tulokset ovat ristiriidassa propytsamidin, joka ei vaikuta aktiinifilamentteihin, ja latrunkuliini B:n, aktiini-depolymeraattorin, joka ei vaikuta mikrotubuluksiin, vaikutusten kanssa (lisäkuva S6). Lisäksi käsittely kumamonamidi 1:llä, kumamonamidihappo 6:lla tai KAND 11:llä ei vaikuttanut mikrotubuluksiin HeLa-soluissa (lisäkuva S7). Näin ollen KAND 11:n vaikutusmekanismin uskotaan olevan erilainen kuin tunnettujen sytoskeleton häiritsevien aineiden. Lisäksi mikroskooppinen havaintomme KAND 11:llä käsitellyistä BY-2-soluista paljasti solukuoleman alkamisen KAND 11 -käsittelyn aikana ja osoitti, että Evans-siniseksi värjäytyneiden kuolleiden solujen osuus ei lisääntynyt merkittävästi 30 minuutin KAND 11 -käsittelyn jälkeen, kun taas 90 minuutin 50 μM:n tai 100 μM:n KAND-käsittelyn jälkeen kuolleiden solujen määrä kasvoi vastaavasti 43,7 %:iin ja 80,1 %:iin (kuva 7c). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että uusi ursolihappojohdannainen KAND 11 on kasvispesifinen sytoskeleton estäjä, jolla on aiemmin tuntematon vaikutusmekanismi.
KAND vaikuttaa tupakkatuotteiden BY-2-solujen kortikaalisiin mikrotubuluksiin, aktiinifilamentteihin ja elinkykyyn. (a) BY-2-solujen kortikaalisten mikrotubulusten visualisointi TagRFP-TUA6:n läsnä ollessa. KAND 11:llä (50 μM tai 100 μM) tai DMSO:lla käsiteltyjä BY-2-soluja tutkittiin konfokaalimikroskopialla. Aivokuoren mikrotubulusten tiheys laskettiin 25 itsenäisen solun mikrokuvista. Kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (Tukey HSD -testi, p< 0,05). Skaalapalkki = 10 µm. (b) BY-2-solujen kortikaaliset aktiinifilamentit visualisoituna GFP-ABD2:n läsnä ollessa. KAND 11:llä (50 μM tai 100 μM) tai DMSO:lla käsiteltyjä BY-2-soluja tutkittiin konfokaalimikroskopialla. Aivokuoren aktiinifilamenttien tiheys laskettiin 25 itsenäisen solun mikrokuvista. Kirjaimet osoittavat merkittäviä eroja (Tukey HSD -testi, p< 0,05). Skaalapalkki = 10 µm. (c) Kuolleiden BY-2-solujen tarkastelu Evans-sinivärjäyksellä. KAND 11:llä (50 μM tai 100 μM) tai DMSO:lla käsiteltyjä BY-2-soluja tutkittiin kirkaskenttämikroskopialla. n=3. Skaalapalkki = 100 µm.
Uusien luonnontuotteiden löytäminen ja soveltaminen on johtanut merkittäviin edistysaskeliin ihmiselämän eri osa-alueilla, mukaan lukien lääketiede ja maatalous. Historiallista tutkimusta on tehty hyödyllisten yhdisteiden löytämiseksi luonnonvaroista. Erityisesti aktinomykeettien tiedetään olevan hyödyllisiä antibiootteja sukkulamatojen torjuntaan, koska ne pystyvät tuottamaan erilaisia sekundaarisia metaboliitteja, kuten avermektiiniä, ivermektiinin lyijyyhdistettä, sekä bleomysiiniä ja sen johdannaisia, joita käytetään lääkinnällisesti syöpälääkkeenä21,22. Samoin aktinomykeeteistä on löydetty useita rikkakasvien torjunta-aineita, joista joitakin käytetään jo kaupallisesti1,23. Siksi aktinomykeettien metaboliittien analysointia haluttujen biologisten aktiivisuuksien omaavien luonnontuotteiden eristämiseksi pidetään tehokkaana strategiana. Tässä tutkimuksessa löysimme uuden yhdisteen, kumamamonamidin, S. werraensis -sienestä ja syntetisoimme sen onnistuneesti. Ursonihappo on urbenamidin ja sen johdannaisten synteettinen välituote. Se voi aiheuttaa tyypillistä juurien käpristymistä, osoittaa kohtalaista tai voimakasta rikkakasvien torjunta-ainetta ja vahingoittaa suoraan tai epäsuorasti kasvien mikrotubuluksia. Urmotonihapon vaikutusmekanismi voi kuitenkin poiketa olemassa olevien mikrotubulusten estäjien vaikutusmekanismista, koska KAND 11 myös häiritsee aktiinifilamentteja ja aiheuttaa solukuolemaa, mikä viittaa säätelymekanismiin, jolla urmotonihappo ja sen johdannaiset vaikuttavat laajaan valikoimaan sytoskeleton rakenteita.
Urbenonihapon tarkempi karakterisointi auttaa ymmärtämään paremmin sen vaikutusmekanismia. Seuraavana tavoitteena on erityisesti arvioida ursonihapon kykyä sitoutua pelkistyneisiin mikrotubuluksiin sen määrittämiseksi, vaikuttavatko ursonihappo ja sen johdannaiset suoraan mikrotubuluksiin ja depolymerisoivatko ne vai johtavatko niiden toiminta mikrotubulusten epävakauteen. Lisäksi tapauksissa, joissa mikrotubulukset eivät ole suora kohde, ursonihapon vaikutuspaikan ja molekyylikohteiden tunnistaminen kasvisoluissa auttaa ymmärtämään paremmin samankaltaisten yhdisteiden ominaisuuksia ja mahdollisia tapoja parantaa rikkakasvien torjunta-ainetta. Bioaktiivisuusmäärityksemme paljasti ursonihapon ainutlaatuisen sytotoksisen kyvyn kasvien, kuten Arabidopsis thalianan, tupakan ja maksayrtin, kasvuun, kun taas E. coli- tai HeLa-soluihin ei kohdistunut vaikutusta. Ursonihappojohdannaisten vähäinen tai olematon myrkyllisyys eläinsoluille on etu, jos niitä kehitetään rikkakasvien torjunta-aineiksi käytettäväksi avoimilla maatalousalueilla. Koska mikrotubulukset ovat yleisiä rakenteita eukaryooteissa, niiden selektiivinen esto kasveissa on keskeinen vaatimus rikkakasvien torjunta-aineille. Esimerkiksi propytsamidia, mikrotubulusten depolymeroivaa ainetta, joka sitoutuu suoraan tubuliiniin ja estää polymeroitumista, käytetään rikkakasvien torjunta-aineena sen vähäisen myrkyllisyyden vuoksi eläinsoluille24. Toisin kuin disopyramidilla, samankaltaisilla bentsamideilla on erilaiset kohdespesifisyydet. Kasvien mikrotubulusten lisäksi RH-4032 tai bentsoksamidi estää myös eläinsolujen tai munasienten mikrotubuluksia, ja zalilamidia käytetään sienitautien torjunta-aineena sen vähäisen fytotoksisuuden vuoksi25,26,27. Äskettäin löydetty karhu ja sen johdannaiset osoittavat selektiivistä sytotoksisuutta kasveja vastaan, mutta on syytä huomata, että lisämuokkaukset voivat muuttaa niiden kohdespesifisyyttä, mikä voi tarjota lisää johdannaisia patogeenisten sienten tai munasienten torjuntaan.
Urbenonihapon ja sen johdannaisten ainutlaatuiset ominaisuudet ovat hyödyllisiä niiden kehittämisessä rikkakasvien torjunta-aineina ja tutkimusvälineinä. Sytoskeletonin merkitys kasvisolun muodon säätelyssä on laajalti tunnustettu. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvit ovat kehittäneet monimutkaisia aivokuoren mikrotubulusten organisoitumismekanismeja säätelemällä mikrotubulusten dynamiikkaa morfogeneesin hallitsemiseksi. Suuri määrä mikrotubulusten aktiivisuuden säätelystä vastaavia molekyylejä on tunnistettu, ja asiaan liittyvä tutkimus on edelleen käynnissä3,4,28. Nykyinen ymmärryksemme kasvisolujen mikrotubulusten dynamiikasta ei täysin selitä aivokuoren mikrotubulusten organisaatiomekanismeja. Esimerkiksi, vaikka sekä disopyramidi että orytsaliini voivat depolymeroida mikrotubuluksia, disopyramidi aiheuttaa vakavaa juurien vääristymää, kun taas orytsaliinilla on suhteellisen lievä vaikutus. Lisäksi tubuliinin mutaatiot, jotka stabiloivat mikrotubuluksia, aiheuttavat myös juurien oikealle kääntymistä, kun taas paklitakseli, joka myös stabiloi mikrotubulusten dynamiikkaa, ei aiheuta sitä. Siksi ursolihapon molekyylikohteiden tutkiminen ja tunnistaminen tarjoaa uusia näkemyksiä kasvien aivokuoren mikrotubulusten säätelyyn. Samoin tulevat vertailut vääristyneen kasvun edistämisessä tehokkaista kemikaaleista, kuten disopyramidista, ja vähemmän tehokkaista kemikaaleista, kuten oryzaliinista tai kumamotorihaposta, antavat vihjeitä siitä, miten vääristynyt kasvu tapahtuu.
Toisaalta puolustukseen liittyvät sytoskeleton uudelleenjärjestelyt ovat toinen mahdollisuus selittää ursonihapon sytotoksisuutta. Patogeenin infektio tai elisiittorin lisääminen kasvisoluihin aiheuttaa joskus sytoskeleton tuhoutumisen ja sitä seuraavan solukuoleman29. Esimerkiksi munasienistä peräisin olevan kryptoksantiini on raportoitu häiritsevän mikrotubuluksia ja aktiinifilamentteja ennen tupakkasolujen kuolemaa, samalla tavalla kuin KAND-käsittelyn yhteydessä30,31. Ursonihapon aiheuttamien puolustusvasteiden ja soluvasteiden samankaltaisuudet johtivat meidät olettamaan, että ne käynnistävät yleisiä soluprosesseja, vaikka ursonihapon nopeampi ja voimakkaampi vaikutus kuin kryptoksantiini on ilmeinen. Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että aktiinifilamenttien häiriintyminen edistää spontaania solukuolemaa, johon ei aina liity mikrotubulusten häiriintymistä29. Lisäksi on vielä epäselvää, aiheuttaako joko patogeeni vai elisiittori vääristynyttä juurikasvua, kuten ursonihappojohdannaiset. Siten molekyylitietämys, joka yhdistää puolustusvasteet ja sytoskeleton, on houkutteleva ongelma, johon on puututtava. Hyödyntämällä ursonihapon kaltaisten pienimolekyylipainoisten yhdisteiden sekä useiden eri tehoisten johdannaisten läsnäoloa ne voivat tarjota mahdollisuuksia kohdistaa tuntemattomia solumekanismeja.
Yhteenvetona voidaan todeta, että uusien mikrotubulusten dynamiikkaa moduloivien yhdisteiden löytäminen ja soveltaminen tarjoaa tehokkaita menetelmiä kasvisolujen muodon määräytymisen taustalla olevien monimutkaisten molekyylimekanismien tutkimiseksi. Tässä yhteydessä äskettäin kehitetty yhdiste urmotonihappo, joka vaikuttaa mikrotubuluksiin ja aktiinifilamentteihin ja indusoi solukuolemaa, voi tarjota mahdollisuuden selvittää mikrotubulusten säätelyn ja näiden muiden mekanismien välistä yhteyttä. Siten kemiallinen ja biologinen analyysi urbenonihapolla auttaa meitä ymmärtämään kasvin sytoskelettoa sääteleviä molekyylisäätelymekanismeja.
Inokuloi S. werraensis MK493-CF1 500 ml:n välilevyllä varustettuun Erlenmeyer-pulloon, joka sisältää 110 ml viljelyalustaa, joka koostuu 2 % (w/v) galaktoosista, 2 % (w/v) Essence-tahnasta, 1 % (w/v) Bacto-koostumuksesta. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) maissiuutteesta (KOGOSTCH Co., Ltd., Japani), 0,2 % (w/v) (NH4)2SO4:sta ja 0,2 % CaCO3:sta deionisoidussa vedessä. (pH 7,4 ennen sterilointia). Siemenviljelmiä inkuboitiin pyörivässä ravistelijassa (180 rpm) 27 °C:ssa 2 päivän ajan. Tuotantoviljely kiinteän olomuodon fermentaatiolla. Siemenviljelmä (7 ml) siirrettiin 500 ml:n K-1-pulloon, joka sisälsi 40 g tuotantoalustaa, joka koostui 15 g:sta puristettua ohraa (MUSO Co., Ltd., Japani) ja 25 g:sta deionisoitua vettä (pH:ta ei säädetty ennen sterilointia). Käyminen suoritettiin 30 °C:ssa pimeässä 14 päivän ajan. Käymismateriaali uutettiin 40 ml:lla/pullo EtOH:ta ja sentrifugoitiin (1500 g, 4 °C, 10 min). Viljelmäsupernatantti (60 ml) uutettiin 10 % MeOH/EtOAc-seoksella. Orgaaninen kerros haihdutettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin jäännös (59,5 mg), joka ajettiin HPLC:llä gradienttieluoinnilla (0–10 minuuttia: 90 %) käänteisfaasikolonnilla (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, sisähalkaisija 10 mm × pituus 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuuttia: 90 % H2O/CH3CN - 70 % H2O/CH3CN (gradientti), 35–45 minuuttia: 90 % H2O/EtOH, 45–155 minuuttia: 90 % H2O/EtOH - 100 % EtOH (gradientti (gradientti), 155–200 min: 100 % EtOH) virtausnopeudella 1,5 ml/min, jolloin eristettiin kumamoninamidi (1, 36,0 mg) valkoisena amorfisena jauheena.
Kumamotoamidi(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ laskettu arvo: 141,0659, mitattu arvo: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbian siemenet (Col-0) saatiin Arabidopsis Biological Resource Centeristä (ABRC) tutkimuskäyttöön tarkoitetulla luvalla. Col-0-siemeniä lisättiin ja ylläpidettiin laboratorio-olosuhteissamme ja niitä käytettiin villityypin Arabidopsis-kasveina. Arabidopsis-siemenet pintasteriloitiin ja viljeltiin puolivahvassa Murashige- ja Skoog-elatusaineessa, joka sisälsi 2 % sakkaroosia (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (w/v) 2-(4-morfolino)etaanisulfonihappoa (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) ja 1,5 % agaria (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C:ssa ja jatkuvassa valossa. phs1-1-mutantin siemenet toimitti T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
SR-1-kannan siemenet toimitti T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) ja niitä käytettiin villityypin tupakkakasveina. Tupakansiemenet steriloitiin pintansa puolesta ja liotettiin steriilissä vedessä kolme yötä itämisen edistämiseksi, minkä jälkeen ne laitettiin puolivahvaan liuokseen, joka sisälsi 2 % sakkaroosia, 0,05 % (w/v) MES:iä ja 0,8 % gellaanikumia (Fujifilm Wako Pure Chemical) (Murashige- ja Skoog-elatusaine), jonka pH oli 5,7, ja inkuboitiin 23 °C:ssa jatkuvassa valossa.
Kanta Tak-1 saatiin T. Kohchilta (Kioton yliopisto), ja sitä käytettiin maksayrttitutkimuksen standardikoeyksikkönä. Gema-bakteerit saatiin steriloiduista viljellyistä kasveista ja levitettiin sitten Gamborg B5 -elatusaineelle (Fujifilm Wako Pure Chemical), joka sisälsi 1 % sakkaroosia ja 0,3 % gellaanikumia, ja inkuboitiin 23 °C:ssa jatkuvassa valossa.
Tupakkakasvien BY-2-solut (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) toimitti S. Hasezawa (Tokion yliopisto). BY-2-solut laimennettiin 95-kertaisesti modifioituun Linsmeier- ja Skoog-elatusaineeseen ja niitä täydennettiin viikoittain 2,4-dikloorifenoksietikkahapolla 32. Solususpensiota sekoitettiin pyörivässä ravistelijassa nopeudella 130 rpm 27 °C:ssa pimeässä. Solut pestään 10-kertaisella tilavuudella tuoretta elatusainetta ja suspendoidaan uudelleen samaan elatusaineeseen. BY-2-transgeeniset solulinjat, jotka ilmentävät stabiilisti mikrotubulusmarkkeria TagRFP-TUA6 tai aktiinifilamenttimarkkeria GFP-ABD2 kukkakaalin mosaiikkiviruksen 35S-promoottorin alla, luotiin aiemmin kuvatulla tavalla 33,34,35. Näitä solulinjoja voidaan ylläpitää ja synkronoida käyttämällä samanlaisia menetelmiä kuin alkuperäisen BY-2-solulinjan kanssa.
HeLa-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-elatusaineessa (DMEM) (Life Technologies), johon oli lisätty 10 % naudan sikiön seerumia, 1,2 U/ml penisilliiniä ja 1,2 μg/ml streptomysiiniä, 37 °C:n inkubaattorissa, jossa oli 5 % CO2:ta.
Kaikki tässä käsikirjoituksessa kuvatut kokeet suoritettiin japanilaisten bioturvallisuusmääräysten ja -ohjeiden mukaisesti.
Yhdisteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kantaliuoksiksi ja laimennettiin MS-elatusaineeseen Arabidopsis- ja tupakkakasvien osalta tai Gamborg B5 -elatusaineeseen maksasairaalan osalta. Juuren kasvun estymismääritystä varten kylvettiin yli 10 siementä levyä kohden agar-alustalle, joka sisälsi ilmoitettuja yhdisteitä tai DMSO:ta. Siemeniä inkuboitiin kasvukammiossa 7 päivän ajan. Taimet valokuvattiin ja juurien pituus mitattiin. Arabidopsis-itävyysmääritystä varten kylvettiin 48 siementä levyä kohden agar-alustalle, joka sisälsi 200 μM yhdistettä tai DMSO:ta. Arabidopsis-siemeniä kasvatettiin kasvukammiossa ja itäneiden taimien lukumäärä laskettiin 7 päivää itämisen jälkeen (dag). Tupakan itävyysmääritystä varten kylvettiin 24 siementä levyä kohden agar-alustalle, joka sisälsi 200 μM KAND:ta tai DMSO:ta. Tupakansiemeniä kasvatettiin kasvukammiossa ja itäneiden taimien lukumäärä laskettiin 14 päivän kuluttua. Maksayrtin kasvun estomääritystä varten kultakin levyltä asetettiin yhdeksän alkiota agar-agarille, joka sisälsi ilmoitetut KAND- tai DMSO-pitoisuudet, ja niitä inkuboitiin kasvukammiossa 14 päivän ajan.
Juurimeristeemiorganisaation visualisoimiseksi käytettiin 5 mg/ml propidiumjodidilla (PI) värjättyjä taimia. PI-signaaleja havaittiin fluoresenssimikroskopialla käyttäen TCS SPE -konfokaalista laserskannausmikroskooppia (Leica Microsystems).
Juurten histokemiallinen värjäys β-glukuronidaasilla (GUS) suoritettiin Malamin ja Benfeyn36 kuvaaman protokollan mukaisesti. Taimet kiinnitettiin 90-prosenttisessa asetonissa yön yli, värjättiin 0,5 mg/ml 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-β-d-glukuronihapolla GUS-puskurissa yhden tunnin ajan ja asetettiin hydratoituun kloorialdehydiliuokseen (8 g kloraalihydraattia, 2 ml vettä ja 1 ml glyserolia) ja tutkittiin differentiaalisella interferenssikontrastimikroskopialla käyttäen Axio Imager M1 -mikroskooppia (Carl Zeiss).
Juurikulmat mitattiin 7 päivän ikäisistä taimista, jotka oli kasvatettu pystysuoraan asetelluilla levyillä. Mittaa juuren kulma painovoimavektorin suunnasta vaiheessa 6 kuvatulla tavalla.
Aivokuoren mikrotubulusten järjestystä tarkasteltiin kuvatulla tavalla, pienin muutoksin protokollaan 37. Primaarisena ja sekundaarisena vasta-aineena käytettiin anti-β-tubuliini-vasta-ainetta (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ja Alexa Fluor 488 -konjugoitua hiiren vasta-ainetta (Thermo Fisher Scientific: A32723) laimennoksina 1:1000 ja 1:100. Fluoresenssikuvat hankittiin käyttämällä TCS SPE -konfokaalista laserskannausmikroskooppia (Leica Microsystems). Hanki Z-pino-kuvia ja luo maksimi-intensiteettiprojektiot valmistajan ohjeiden mukaisesti.
HeLa-solujen lisääntymismääritys suoritettiin käyttämällä Cell Counting Kit 8:aa (Dojindo) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
E. coli DH5α:n kasvua analysoitiin mittaamalla solutiheys viljelmässä spektrofotometrillä aallonpituudella 600 nm (OD600).
Transgeenisten BY-2-solujen sytoskeletin organisaatiota tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla, joka oli varustettu CSU-X1-konfokaaliskannauslaitteella (Yokogawa) ja sCMOS-kameralla (Zyla, Andor Technology). Sytoskeletin tiheys arvioitiin kuva-analyysillä, jossa määritettiin sytoskeleton pikseleiden prosenttiosuus sytoplasman pikseleistä konfokaalikuvissa käyttäen ImageJ-ohjelmistoa aiemmin kuvatulla tavalla38,39.
BY-2-solujen solukuoleman havaitsemiseksi solususpensiota inkuboitiin 0,05 %:n Evans-sinisen kanssa 10 minuuttia huoneenlämmössä. Kuolleiden solujen selektiivinen Evans-sininen värjäys perustuu väriaineen poistumiseen elinkelpoisista soluista ehjän solukalvon läpi.40 Värjäytyneitä soluja tarkasteltiin kirkaskenttämikroskoopilla (BX53, Olympus).
HeLa-soluja kasvatettiin DMEM-viljelmässä, johon oli lisätty 10 % FBS:ää, kostutetussa inkubaattorissa 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Soluja käsiteltiin 100 μM KAND 11:llä, kumamonamiinihapolla 6:lla, kumamonamidi 1:llä, 100 ng/ml kolsemidilla (Gibco) tai 100 ng/ml Nocodmazella (Sigma) 6 tunnin ajan 37 °C:ssa. Solut kiinnitettiin metanolilla 10 minuuttia ja sitten asetaatilla 5 minuuttia huoneenlämmössä. Kiinnitettyjä soluja inkuboitiin β-tubuliini-primaarisen vasta-aineen (1D4A4, Proteintech: 66240-1) kanssa, joka oli laimennettu 0,5 % BSA/PBS:ään, 2 tunnin ajan, pestiin kolme kertaa TBST:llä ja inkuboitiin sitten Alexa Fluor -vuohen vasta-aineen kanssa. 488 1 tunti. – Hiiren IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ja 15 ng/ml 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolia (DAPI) laimennettuna 0,5 % BSA/PBS:ään. Kolmen TBST-pesun jälkeen värjäytyneitä soluja tarkasteltiin Nikon Eclipse Ti-E -käänteismikroskoopilla. Kuvat otettiin jäähdytetyllä Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kameralla käyttäen MetaMorph-ohjelmistoa (Molecular Devices).
Julkaisun aika: 17. kesäkuuta 2024