Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan tuloksen saavuttamiseksi suosittelemme, että käytät uudempaa selainversiota (tai poistat yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylittelyä tai JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Kasviperäisten hyönteismyrkkyjen yhdistelmät voivat osoittaa synergistisiä tai antagonistisia vuorovaikutuksia tuholaisia vastaan. Koska Aedes-hyttysten levittämät taudit leviävät nopeasti ja Aedes-hyttyspopulaatiot ovat yhä vastustuskykyisempiä perinteisille hyönteismyrkkyille, formuloitiin ja testattiin 28 kasvien eteerisiin öljyihin perustuvaa terpeeniyhdisteiden yhdistelmää Aedes aegypti -hyttysen toukka- ja aikuisvaiheita vastaan. Viisi kasvien eteeristä öljyä (EO) arvioitiin aluksi niiden toukkamyrkky- ja aikuisvaiheiden tehokkuuden suhteen, ja kustakin EO:sta tunnistettiin kaksi pääyhdistettä GC-MS-tulosten perusteella. Tärkeimmät tunnistetut yhdisteet hankittiin: diallyylidisulfidi, diallyylitrisulfidi, karvoni, limoneeni, eugenoli, metyylieugenoli, eukalyptoli, eudesmoli ja hyttysen alfa-pineeni. Näiden yhdisteiden binääriyhdistelmiä valmistettiin sitten käyttäen subletaalisia annoksia, ja niiden synergistiset ja antagonistiset vaikutukset testattiin ja määritettiin. Parhaat toukkamyrkkykoostumukset saadaan sekoittamalla limoneenia diallyylidisulfidin kanssa, ja parhaat aikuisten myrkkykoostumukset saadaan sekoittamalla karvonia limoneeniin. Kaupallisesti käytettyä synteettistä toukkamyrkkyä Temphosia ja aikuisille tarkoitettua lääkettä Malathionia testattiin erikseen ja binäärisinä yhdistelminä terpenoidien kanssa. Tulokset osoittivat, että temefosin ja diallyylidisulfidin sekä malationin ja eudesmolin yhdistelmä oli tehokkain. Näillä tehokkailla yhdistelmillä on potentiaalia käyttää niitä Aedes aegypti -sientä vastaan.
Kasvien eteeriset öljyt (EO) ovat sekundaarisia metaboliitteja, jotka sisältävät erilaisia bioaktiivisia yhdisteitä, ja niistä on tulossa yhä tärkeämpiä vaihtoehtoja synteettisille torjunta-aineille. Ne ovat paitsi ympäristö- ja käyttäjäystävällisiä, myös sekoitus erilaisia bioaktiivisia yhdisteitä, mikä myös vähentää lääkeresistenssin kehittymisen todennäköisyyttä1. GC-MS-teknologiaa käyttäen tutkijat tarkastelivat eri kasvien eteeristen öljyjen ainesosia ja tunnistivat yli 3 000 yhdistettä 17 500 aromaattisesta kasvista2, joista useimpia testattiin hyönteismyrkkyominaisuuksien varalta ja niillä on raportoitu olevan hyönteismyrkkyvaikutuksia3,4. Jotkut tutkimukset korostavat, että yhdisteen pääkomponentin myrkyllisyys on sama tai suurempi kuin sen raa'an etyleenioksidin. Yksittäisten yhdisteiden käyttö voi kuitenkin jälleen jättää tilaa resistenssin kehittymiselle, kuten kemiallisten hyönteismyrkkyjen tapauksessa5,6. Siksi nykyinen painopiste on etyleenioksidipohjaisten yhdisteiden seosten valmistamisessa hyönteismyrkkytehokkuuden parantamiseksi ja resistenssin todennäköisyyden vähentämiseksi kohdetuholaispopulaatioissa. Eteeristen öljyjen yksittäisillä aktiivisilla yhdisteillä voi olla synergistisiä tai antagonistisia vaikutuksia yhdistelmissä, jotka heijastavat eteerisen öljyn kokonaisaktiivisuutta, mikä on aiempien tutkijoiden tekemissä tutkimuksissa korostunut paljon7,8. Vektoritorjuntaohjelma sisältää myös eteerisen öljyn ja sen komponentit. Eteeristen öljyjen hyttysiä tappavaa vaikutusta on tutkittu laajasti Culex- ja Anopheles-hyttysillä. Useissa tutkimuksissa on pyritty kehittämään tehokkaita torjunta-aineita yhdistämällä erilaisia kasveja kaupallisesti käytettyihin synteettisiin torjunta-aineisiin kokonaistoksisuuden lisäämiseksi ja sivuvaikutusten minimoimiseksi9. Tällaisten yhdisteiden tutkimukset Aedes aegypti -hyttysiä vastaan ovat kuitenkin edelleen harvinaisia. Lääketieteen edistysaskeleet sekä lääkkeiden ja rokotteiden kehitys ovat auttaneet torjumaan joitakin vektorivälitteisiä tauteja. Mutta Aedes aegypti -hyttysen levittämän viruksen eri serotyyppien esiintyminen on johtanut rokotusohjelmien epäonnistumiseen. Siksi, kun tällaisia tauteja esiintyy, vektoritorjuntaohjelmat ovat ainoa vaihtoehto taudin leviämisen estämiseksi. Nykytilanteessa Aedes aegypti -sienen torjunta on erittäin tärkeää, koska se on keskeinen vektori useille viruksille ja niiden serotyypeille, jotka aiheuttavat denguekuumetta, zikakuumetta, dengueverenvuotokuumetta, keltakuumetta jne. Merkittävää on se, että lähes kaikkien vektorivälitteisten Aedes-sienen levittämien tautien tapausten määrä kasvaa vuosittain Egyptissä ja maailmanlaajuisesti. Siksi tässä yhteydessä on kiireellisesti kehitettävä ympäristöystävällisiä ja tehokkaita torjuntatoimenpiteitä Aedes aegypti -populaatioiden torjumiseksi. Mahdollisia ehdokkaita tässä suhteessa ovat eteeriset öljyt, niiden ainesosat ja niiden yhdistelmät. Siksi tässä tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan tehokkaita synergistisiä yhdistelmiä keskeisistä kasvien eteeristen öljyjen yhdisteistä viidestä hyönteismyrkkyominaisuuksilla varustetusta kasvista (eli minttu, pyhä basilika, eukalyptustäplä, sulphur allium sulphur ja melaleuca) Aedes aegypti -sientä vastaan.
Kaikilla valituilla etyleenioksidilla oli potentiaalista toukkia tappavaa vaikutusta Aedes aegypti -sieneen (Aedes aegypti) 24 tunnin LC50-arvon vaihtellessa välillä 0,42–163,65 ppm. Korkein toukkia tappava vaikutus kirjattiin piparminttuetyleenioksidilla (Mp), jonka LC50-arvo oli 0,42 ppm 24 tunnin kohdalla, ja seuraavaksi eniten toukkia tappavaa vaikutusta havaittiin valkosipulilla (As), jonka LC50-arvo oli 16,19 ppm 24 tunnin kohdalla (taulukko 1).
Lukuun ottamatta Ocimum Sainttum, Os EO:ta, kaikilla neljällä muulla seulotulla eteerisellä öljyllä oli selviä allergeeneja, joiden LC50-arvot vaihtelivat 23,37:stä 120,16 ppm:ään 24 tunnin altistusjakson aikana. Thymophilus striata (Cl) EO oli tehokkain aikuisten tappamisessa LC50-arvolla 23,37 ppm 24 tunnin kuluessa altistuksesta, jota seurasi Eucalyptus maculata (Em), jonka LC50-arvo oli 101,91 ppm (taulukko 1). Toisaalta Os:n LC50-arvoa ei ole vielä määritetty, koska korkein kuolleisuus, 53 %, kirjattiin suurimmalla annoksella (lisäkuva 3).
Kunkin EO:n kaksi tärkeintä ainesosayhdistettä tunnistettiin ja valittiin NIST-kirjastotietokannan tulosten, GC-kromatogrammin pinta-alan prosenttiosuuden ja MS-spektrien tulosten perusteella (taulukko 2). EO As:n tärkeimmät tunnistetut yhdisteet olivat diallyylidisulfidi ja diallyylitrisulfidi; EO Mp:n tärkeimmät tunnistetut yhdisteet olivat karvoni ja limoneeni, EO Em:n tärkeimmät tunnistetut yhdisteet olivat eudesmoli ja eukalyptoli; EO Os:n tärkeimmät tunnistetut yhdisteet olivat eugenoli ja metyylieugenoli, ja EO Cl:n tärkeimmät tunnistetut yhdisteet olivat eugenoli ja α-pineeni (kuva 1, lisäkuvat 5–8, lisätaulukko 1–5).
Valittujen eteeristen öljyjen pääterpenoidien massaspektrometrian tulokset (A-diallyylidisulfidi; B-diallyylitrisulfidi; C-eugenoli; D-metyylieugenoli; E-limoneeni; F-aromaattinen seperoni; G-α-pineeni; H-kineoli; R-eudamoli).
Yhteensä yhdeksän yhdistettä (diallyylidisulfidi, diallyylitrisulfidi, eugenoli, metyylieugenoli, karvoni, limoneeni, eukalyptoli, eudesmoli, α-pineeni) tunnistettiin tehokkaiksi yhdisteiksi, jotka ovat EO:n pääkomponentteja, ja niitä testattiin erikseen Aedes aegypti -sientä vastaan toukkavaiheissa. Yhdisteellä eudesmol oli korkein toukkia tappava vaikutus, LC50-arvolla 2,25 ppm 24 tunnin altistuksen jälkeen. Myös yhdisteillä diallyylidisulfidi ja diallyylitrisulfidi on havaittu olevan potentiaalisia toukkia tappavia vaikutuksia, keskimääräisten subletaalien annosten ollessa 10–20 ppm. Kohtalaista toukkia tappavaa vaikutusta havaittiin jälleen yhdisteillä eugenoli, limoneeni ja eukalyptoli, joiden LC50-arvot olivat 63,35 ppm, 139,29 ppm ja 181,33 ppm 24 tunnin kuluttua (taulukko 3). Metyylieugenolilla ja karvonilla ei kuitenkaan havaittu merkittävää toukkia tappavaa potentiaalia edes suurimmilla annoksilla, joten LC50-arvoja ei laskettu (taulukko 3). Synteettisen toukkia tappavan Temephos-nimisen toukkia tappavan aineen keskimääräinen pitoisuus Aedes aegyptiä vastaan oli 0,43 ppm 24 tunnin altistuksen aikana (taulukko 3, lisätaulukko 6).
Seitsemän yhdistettä (diallyylidisulfidi, diallyylitrisulfidi, eukalyptoli, α-pineeni, eudesmoli, limoneeni ja karvoni) tunnistettiin tehokkaimmiksi etyleenioksidiksi (EO), ja niitä testattiin yksi kerrallaan aikuisia egyptiläisiä Aedes-hyttysiä vastaan. Probit-regressioanalyysin mukaan eudesmolilla havaittiin olevan suurin potentiaali LC50-arvolla 1,82 ppm, jota seurasi eukalyptoli LC50-arvolla 17,60 ppm 24 tunnin altistusajalla. Loput viisi testattua yhdistettä olivat kohtalaisen haitallisia aikuisille LC50-arvojen vaihteleessa 140,79–737,01 ppm (taulukko 3). Synteettinen organofosforimalationi oli heikompi kuin eudesmoli ja voimakkaampi kuin muut kuusi yhdistettä LC50-arvolla 5,44 ppm 24 tunnin altistusajalla (taulukko 3, lisätaulukko 6).
Seitsemän voimakasta lyijy-yhdistettä ja organofosfori tamefosaattia valittiin formuloimaan niiden LC50-annosten binaarisia yhdistelmiä suhteessa 1:1. Yhteensä 28 binääristä yhdistelmää valmistettiin ja testattiin niiden toukkia tappavan tehon suhteen Aedes aegypti -sientä vastaan. Yhdeksän yhdistelmän havaittiin olevan synergistisiä, 14 yhdistelmää oli antagonistisia ja viisi yhdistelmää ei ollut toukkia tappavia. Synergististen yhdistelmien joukossa diallyylidisulfidin ja temofolin yhdistelmä oli tehokkain, ja kuolleisuus havaittiin 100 %:ssa 24 tunnin kuluttua (taulukko 4). Vastaavasti limoneenin ja diallyylidisulfidin sekä eugenolin ja tymometfosin seokset osoittivat hyvää potentiaalia, ja toukkien kuolleisuus oli 98,3 % (taulukko 5). Loput neljä yhdistelmää, nimittäin eudesmol ja eukalyptoli, eudesmol ja limoneeni, eukalyptoli ja alfa-pineeni, alfa-pineeni ja temefossi, osoittivat myös merkittävää toukkia tappavaa tehoa, ja havaittu kuolleisuus oli yli 90 %. Odotettu kuolleisuus on lähellä 60–75 %. (taulukko 4). Limoneenin ja α-pineenin tai eukalyptuksen yhdistelmä osoitti kuitenkin antagonistisia reaktioita. Samoin Temephosin ja eugenolin tai eukalyptuksen tai eudesmolin tai diallyylitrisulfidin seosten on havaittu olevan antagonistisia vaikutuksia. Samoin diallyylidisulfidin ja diallyylitrisulfidin yhdistelmä sekä jommankumman näistä yhdisteistä yhdistelmä eudesmolin tai eugenolin kanssa ovat antagonistisia toukkia tappavassa vaikutuksessaan. Antagonismia on raportoitu myös eudesmolin ja eugenolin tai α-pineenin yhdistelmän yhteydessä.
Kaikista 28:sta aikuisten happaman aktiivisuuden testatusta binääriseoksesta 7 yhdistelmää oli synergistisiä, 6:lla ei ollut vaikutusta ja 15 oli antagonistisia. Eudesmolin ja eukalyptuksen sekä limoneenin ja karvonin seosten havaittiin olevan tehokkaampia kuin muut synergistiset yhdistelmät, ja kuolleisuus 24 tunnissa oli 76 % ja 100 % (taulukko 5). Malationin on havaittu osoittavan synergististä vaikutusta kaikkien muiden yhdisteiden yhdistelmien kanssa paitsi limoneenin ja diallyylitrisulfidin kanssa. Toisaalta antagonismia on havaittu diallyylidisulfidin ja diallyylitrisulfidin sekä niiden ja eukalyptuksen, eukalyptolin, karvonin tai limoneenin yhdistelmän välillä. Vastaavasti α-pineenin ja eudesmolin tai limoneenin, eukalyptolin ja karvonin tai limoneenin sekä limoneenin ja eudesmolin tai malationin yhdistelmät osoittivat antagonistisia toukkia tappavia vaikutuksia. Jäljelle jäävillä kuudella yhdistelmällä ei ollut merkittävää eroa odotetun ja havaitun kuolleisuuden välillä (taulukko 5).
Synergististen vaikutusten ja subletaalien annosten perusteella niiden toukkia tappava myrkyllisyys suurta määrää Aedes aegypti -hyttysiä vastaan valittiin lopulta ja testattiin edelleen. Tulokset osoittivat, että havaittu toukkien kuolleisuus käytettäessä binaarisia yhdistelmiä eugenoli-limoneeni, diallyylidisulfidi-limoneeni ja diallyylidisulfidi-timefossi oli 100 %, kun taas odotettu toukkien kuolleisuus oli vastaavasti 76,48 %, 72,16 % ja 63,4 % (taulukko 6). Limoneenin ja eudesmolin yhdistelmä oli suhteellisen tehottomampi, ja toukkien kuolleisuus oli 88 % 24 tunnin altistusjakson aikana (taulukko 6). Yhteenvetona voidaan todeta, että neljä valittua binääristä yhdistelmää osoittivat myös synergistisiä toukkia tappavia vaikutuksia Aedes aegypti -hyttysiä vastaan, kun niitä käytettiin laajamittaisesti (taulukko 6).
Kolme synergististä yhdistelmää valittiin aikuisten hyönteisten tappavaan biomääritykseen suurten aikuisten Aedes aegypti -populaatioiden torjumiseksi. Valitaksemme yhdistelmiä testattavaksi suurissa hyönteisyhdyskunnissa keskityimme ensin kahteen parhaaseen synergistiseen terpeeniyhdistelmään, nimittäin karvoniin ja limoneeniin sekä eukalyptoliin ja eudesmoliin. Toiseksi paras synergistinen yhdistelmä valittiin synteettisen organofosfaattimalationin ja terpenoidien yhdistelmästä. Uskomme, että malationin ja eudesmolin yhdistelmä on paras yhdistelmä testattavaksi suurissa hyönteisyhdyskunnissa, koska sillä on havaittu korkein kuolleisuus ja kandidaattiainesosien erittäin alhaiset LC50-arvot. Malationi osoittaa synergismia yhdessä α-pineenin, diallyylidisulfidin, eukalyptuksen, karvonin ja eudesmolin kanssa. Mutta jos tarkastelemme LC50-arvoja, eudesmolilla on alhaisin arvo (2,25 ppm). Malationin, α-pineenin, diallyylidisulfidin, eukalyptolin ja karvonin lasketut LC50-arvot olivat vastaavasti 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 ja 140,79 ppm. Nämä arvot osoittavat, että malationin ja eudesmolin yhdistelmä on optimaalinen yhdistelmä annostuksen suhteen. Tulokset osoittivat, että karvonin ja limoneenin sekä eudesmolin ja malationin yhdistelmillä havaittu kuolleisuus oli 100 % verrattuna odotettuun 61–65 %:n kuolleisuuteen. Toinen yhdistelmä, eudesmol ja eukalyptoli, osoitti 78,66 %:n kuolleisuusasteen 24 tunnin altistuksen jälkeen verrattuna odotettuun 60 %:n kuolleisuuteen. Kaikki kolme valittua yhdistelmää osoittivat synergistisiä vaikutuksia jopa laajamittaisesti käytettynä aikuista Aedes aegypti -sientä vastaan (taulukko 6).
Tässä tutkimuksessa valitut kasviöljyet, kuten Mp, As, Os, Em ja Cl, osoittivat lupaavia tappavia vaikutuksia Aedes aegypti -sienen toukka- ja aikuisvaiheisiin. Mp-öljyllä oli korkein toukkamyrkkyvaikutus LC50-arvon ollessa 0,42 ppm, jota seurasivat As-, Os- ja Em-öljyt alle 50 ppm:n 24 tunnin kuluttua. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia aiempien hyttysiä ja muita kaksisiipikärpäsiä koskevien tutkimusten kanssa10,11,12,13,14. Vaikka Cl:n toukkamyrkkyvaikutus on alhaisempi kuin muilla eteerisillä öljyillä, LC50-arvon ollessa 163,65 ppm 24 tunnin kuluttua, sen aikuispotentiaali on korkein LC50-arvon ollessa 23,37 ppm 24 tunnin kuluttua. Mp-, As- ja Em-öljyillä oli myös hyvä allergeenivaikutus LC50-arvojen ollessa 100–120 ppm välillä 24 tunnin altistuksen jälkeen, mutta ne olivat suhteellisen alhaisemmat kuin niiden toukkamyrkkyvaikutus. Toisaalta EO Os:lla havaittiin merkityksetön allergisoiva vaikutus jopa suurimmalla terapeuttisella annoksella. Tulokset osoittavat siis, että etyleenioksidin myrkyllisyys kasveille voi vaihdella hyttysten kehitysvaiheen mukaan15. Se riippuu myös etyleenioksidien tunkeutumisnopeudesta hyönteisen elimistöön, niiden vuorovaikutuksesta tiettyjen kohdeentsyymien kanssa ja hyttysen vieroituskyvystä kussakin kehitysvaiheessa16. Suuri määrä tutkimuksia on osoittanut, että pääkomponenttiyhdiste on tärkeä tekijä etyleenioksidin biologisessa aktiivisuudessa, koska se muodostaa suurimman osan kaikista yhdisteistä3,12,17,18. Siksi otimme huomioon kaksi pääyhdistettä kussakin EO:ssa. GC-MS-tulosten perusteella diallyylidisulfidi ja diallyylitrisulfidi tunnistettiin EO As:n pääyhdisteiksi, mikä on yhdenmukaista aiempien raporttien kanssa19,20,21. Vaikka aiemmat raportit osoittivat, että mentoli oli yksi sen pääyhdisteistä, karvoni ja limoneeni tunnistettiin jälleen Mp EO:n pääyhdisteiksi22,23. Os EO:n koostumusprofiili osoitti, että eugenoli ja metyylieugenoli ovat pääyhdisteet, mikä on samansuuntaista kuin aiemmat tutkijat ovat tehneet havaintoja16,24. Eukalyptolin ja eukalyptolin on raportoitu olevan Em-lehtiöljyn pääasialliset yhdisteet, mikä on yhdenmukaista joidenkin tutkijoiden havaintojen25,26 kanssa, mutta ristiriidassa Olaladen ym.27 havaintojen kanssa. Melaleuca-eteerisessä öljyssä havaittiin kineolin ja α-pineenin hallitsevuus, mikä on samansuuntaista kuin aiemmissa tutkimuksissa28,29. Samasta kasvilajista eri paikoissa uutettujen eteeristen öljyjen koostumuksessa ja pitoisuudessa on raportoitu lajinsisäisiä eroja, ja niitä havaittiin myös tässä tutkimuksessa. Näihin eroihin vaikuttavat maantieteelliset kasvien kasvuolosuhteet, sadonkorjuuaika, kehitysvaihe tai kasvin ikä, kemotyyppien esiintyminen jne.22,30,31,32. Keskeiset tunnistetut yhdisteet ostettiin ja testattiin niiden toukkia tappavien vaikutusten ja aikuisiin Aedes aegypti -hyttysiin kohdistuvien vaikutusten varalta. Tulokset osoittivat, että diallyylidisulfidin toukkia tappava vaikutus oli verrattavissa raa'an EO As:n vastaavaan. Diallyylitrisulfidin vaikutus on kuitenkin korkeampi kuin EO As:n. Nämä tulokset ovat samankaltaisia kuin Kimbaris et al. 33 Culex philippines -hyttyksillä saadut tulokset. Nämä kaksi yhdistettä eivät kuitenkaan osoittaneet hyvää itsetuhoavaa vaikutusta kohdehyttysiä vastaan, mikä on yhdenmukaista Plata-Rueda et al. 34 Tenebrio molitor -hyttysten tulosten kanssa. Os EO on tehokas Aedes aegypti -hyttysen toukkavaihetta vastaan, mutta ei aikuisvaihetta vastaan. On osoitettu, että tärkeimpien yksittäisten yhdisteiden toukkia tappava vaikutus on alhaisempi kuin raa'an Os EO:n. Tämä viittaa muiden yhdisteiden ja niiden vuorovaikutusten rooliin raa'assa etyleenioksidissa. Metyylieugenolilla yksinään on merkityksetön vaikutus, kun taas eugenolilla yksinään on kohtalainen toukkia tappava vaikutus. Tämä johtopäätös vahvistaa toisaalta35,36 ja toisaalta on ristiriidassa aiempien tutkijoiden johtopäätösten kanssa37,38. Eugenolin ja metyylieugenolin funktionaalisten ryhmien erot voivat johtaa erilaisiin myrkyllisyyksiin samalle kohdehyönteiselle39. Limoneenilla havaittiin olevan kohtalainen toukkia tappava vaikutus, kun taas karvonin vaikutus oli merkityksetön. Vastaavasti limoneenin suhteellisen alhainen myrkyllisyys aikuisille hyönteisille ja karvonin korkea myrkyllisyys tukevat joidenkin aiempien tutkimusten40 tuloksia, mutta ovat ristiriidassa toisten41 kanssa. Kaksoissidosten läsnäolo sekä syklin sisäisissä että eksosyklisissä asemissa voi lisätä näiden yhdisteiden hyötyjä toukkia tappavina aineina3,41, kun taas karvonilla, joka on tyydyttymättömiä alfa- ja beetahiiliatomeja sisältävä ketoni, voi olla suurempi myrkyllisyyspotentiaali aikuisilla42. Limoneenin ja karvonin yksittäiset ominaisuudet ovat kuitenkin paljon alhaisemmat kuin EO Mp:n kokonaismäärä (taulukko 1, taulukko 3). Testatuista terpenoideista eudesmolilla havaittiin olevan suurin toukkia ja aikuisia tappava vaikutus, ja LC50-arvo oli alle 2,5 ppm, mikä tekee siitä lupaavan yhdisteen Aedes-hyttysten torjuntaan. Sen suorituskyky on parempi kuin koko EO Em:n, vaikka tämä ei olekaan yhdenmukaista Chengin ym. havaintojen kanssa.40 Eudesmol on seskviterpeeni, jossa on kaksi isopreeniyksikköä ja joka on vähemmän haihtuva kuin hapettuneet monoterpeenit, kuten eukalyptus, ja sillä on siksi suurempi potentiaali torjunta-aineena. Eukalyptolilla itsessään on suurempi aikuisten toukkien tappava vaikutus kuin toukkien tappava vaikutus, ja aiempien tutkimusten tulokset sekä tukevat että kumoavat tämän37,43,44. Pelkkä aktiivisuus on lähes verrattavissa koko EO Cl:n aktiivisuuteen. Toisella bisyklisellä monoterpeenillä, α-pineenillä, on Aedes aegyptiin vähemmän aikuisten vaikutusta kuin toukkien tappava vaikutus, mikä on päinvastainen kuin täyden EO Cl:n vaikutus. Terpenoidien kokonaisvaltaiseen hyönteismyrkkyvaikutukseen vaikuttavat niiden lipofiilisyys, haihtuvuus, hiilen haarautuminen, projektiopinta-ala, pinta-ala, funktionaaliset ryhmät ja niiden sijainnit45,46. Nämä yhdisteet voivat toimia tuhoamalla solukertymiä, estämällä hengitystoimintaa, keskeyttämällä hermoimpulssien siirtymisen jne.47 Synteettisellä organofosfaatilla Temephosilla havaittiin olevan korkein toukkia tappava vaikutus LC50-arvolla 0,43 ppm, mikä on yhdenmukaista Lekin tietojen kanssa -Utala48. Synteettisen organofosforimalationin aikuisen aktiivisuuden raportoitiin olevan 5,44 ppm. Vaikka nämä kaksi organofosfaattia ovat osoittaneet suotuisia vasteita Aedes aegypti -laboratoriokantoja vastaan, hyttysten resistenssiä näille yhdisteille on raportoitu eri puolilla maailmaa49. Samanlaisia raportteja resistenssin kehittymisestä rohdosvalmisteille ei kuitenkaan ole löydetty50. Siksi kasviperäisiä aineita pidetään potentiaalisina vaihtoehtoina kemiallisille torjunta-aineille vektorien torjuntaohjelmissa.
Toukkia tappavaa vaikutusta testattiin 28 binäärisellä yhdistelmällä (1:1), jotka oli valmistettu voimakkaista terpenoideista ja terpenoideista thymetfossin kanssa, ja 9 yhdistelmän havaittiin olevan synergistisiä, 14 antagonistisia ja 5 antagonistisia. Ei vaikutusta. Toisaalta aikuisten tehoa mittaavassa biomäärityksessä 7 yhdistelmän havaittiin olevan synergistisiä, 15 yhdistelmää oli antagonistisia ja 6 yhdistelmän raportoitiin olevan tehoton. Syy siihen, miksi tietyt yhdistelmät tuottavat synergistisen vaikutuksen, voi johtua ehdokasyhdisteiden samanaikaisesta vuorovaikutuksesta eri tärkeissä reiteissä tai tietyn biologisen reitin eri keskeisten entsyymien peräkkäisestä estämisestä51. Limoneenin yhdistelmän diallyylidisulfidin, eukalyptuksen tai eugenolin kanssa havaittiin olevan synergistinen sekä pienissä että suurissa sovelluksissa (taulukko 6), kun taas sen yhdistelmällä eukalyptuksen tai α-pineenin kanssa havaittiin olevan antagonistisia vaikutuksia toukkiin. Keskimäärin limoneeni näyttää olevan hyvä synergisti, mahdollisesti metyyliryhmien läsnäolon, hyvän tunkeutumisen sarveiskerrokseen ja erilaisen vaikutusmekanismin ansiosta52,53. Aikaisemmin on raportoitu, että limoneeni voi aiheuttaa myrkyllisiä vaikutuksia tunkeutumalla hyönteisten kynsinauhoihin (kosketustoksisuus), vaikuttamalla ruoansulatusjärjestelmään (ruokailunesto) tai hengityselimiin (kaasutusvaikutus),54 kun taas fenyylipropanoidit, kuten eugenoli, voivat vaikuttaa aineenvaihduntaentsyymeihin55. Siksi eri vaikutusmekanismeja omaavien yhdisteiden yhdistelmät voivat lisätä seoksen kokonaisletaalisuutta. Eukalyptolin havaittiin olevan synergistinen diallyylidisulfidin, eukalyptuksen tai α-pineenin kanssa, mutta muut yhdistelmät muiden yhdisteiden kanssa olivat joko ei-toukkia tappavia tai antagonistisia. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että eukalyptolilla on estävä vaikutus asetyylikoliesteraasiin (AChE) sekä oktaamiini- ja GABA-reseptoreihin56. Koska syklisillä monoterpeeneillä, eukalyptolilla, eugenolilla jne. voi olla sama vaikutusmekanismi kuin niiden neurotoksisella vaikutuksella,57 mikä minimoi niiden yhdistetyt vaikutukset keskinäisen eston kautta. Samoin Temefosin yhdistelmän diallyylidisulfidin, α-pineenin ja limoneenin kanssa havaittiin olevan synergistinen, mikä tukee aiempia raportteja synergistisestä vaikutuksesta kasviperäisten tuotteiden ja synteettisten organofosfaattien välillä58.
Eudesmolin ja eukalyptolin yhdistelmällä havaittiin olevan synergistinen vaikutus Aedes aegyptin toukka- ja aikuisvaiheisiin, mahdollisesti johtuen niiden erilaisista vaikutusmekanismeista niiden erilaisten kemiallisten rakenteiden vuoksi. Eudesmoli (seskviterpeeni) voi vaikuttaa hengityselimiin 59 ja eukalyptoli (monoterpeeni) voi vaikuttaa asetyylikoliiniesteraasiin 60. Ainesosien samanaikainen altistuminen kahdelle tai useammalle kohdealueelle voi lisätä yhdistelmän kokonaisletaalisuutta. Aikuisaineiden biomäärityksissä malationin havaittiin olevan synergistinen karvonin tai eukalyptolin tai eukalyptolin tai diallyylidisulfidin tai α-pineenin kanssa, mikä osoittaa, että se on synergistinen limoneenin ja disulfidin lisäämisen kanssa. Hyviä synergistisiä allergeeniehdokkaita koko terpeeniyhdisteiden valikoimalle, allyylitrisulfidia lukuun ottamatta. Thangam ja Kathiresan 61 raportoivat myös samanlaisia tuloksia malationin synergistisestä vaikutuksesta yrttiuutteiden kanssa. Tämä synergistinen vaste voi johtua malationin ja fytokemikaalien yhdistetyistä myrkyllisistä vaikutuksista hyönteisiä puhdistaviin entsyymeihin. Organofosfaatit, kuten malationi, vaikuttavat yleensä estämällä sytokromi P450 -esteraaseja ja mono-oksigenaaseja62,63,64. Siksi malationin yhdistäminen näihin vaikutusmekanismeihin ja terpeenien, joilla on erilaiset vaikutusmekanismit, voi lisätä hyttysiä tappavaa kokonaisvaikutusta.
Toisaalta antagonismi osoittaa, että valitut yhdisteet ovat yhdistelmänä vähemmän aktiivisia kuin kukin yhdiste yksinään. Antagonismin syynä joissakin yhdistelmissä voi olla se, että yksi yhdiste muuttaa toisen yhdisteen käyttäytymistä muuttamalla imeytymis-, jakautumis-, metabolia- tai erittymisnopeutta. Varhaiset tutkijat pitivät tätä antagonismin syynä lääkeyhdistelmissä. Molekyylit Mahdollinen mekanismi 65. Samoin antagonismin mahdolliset syyt voivat liittyä samankaltaisiin vaikutusmekanismeihin, ainesosien kilpailuun samasta reseptorista tai kohteesta. Joissakin tapauksissa voi esiintyä myös kohdeproteiinin ei-kilpailevaa estoa. Tässä tutkimuksessa kahdella organorikkiyhdisteellä, diallyylidisulfidilla ja diallyylitrisulfidilla, oli antagonistisia vaikutuksia, mahdollisesti johtuen kilpailusta samasta kohteesta. Samoin näillä kahdella rikkiyhdisteellä oli antagonistisia vaikutuksia, eikä niillä ollut vaikutusta yhdistettynä eudesmoliin ja α-pineeniin. Eudesmoli ja alfa-pineeni ovat luonteeltaan syklisiä, kun taas diallyylidisulfidi ja diallyylitrisulfidi ovat luonteeltaan alifaattisia. Kemiallisen rakenteen perusteella näiden yhdisteiden yhdistelmän pitäisi lisätä kokonaisletaalisuutta, koska niiden kohdepaikat ovat yleensä erilaiset34,47, mutta kokeellisesti havaitsimme antagonismia, joka voi johtua näiden yhdisteiden roolista joissakin tuntemattomissa organismeissa in vivo -järjestelmissä vuorovaikutuksen seurauksena. Samoin kineolin ja α-pineenin yhdistelmä tuotti antagonistisia vasteita, vaikka tutkijat ovat aiemmin raportoineet, että näillä kahdella yhdisteellä on erilaiset vaikutuskohteet47,60. Koska molemmat yhdisteet ovat syklisiä monoterpeenejä, voi olla joitakin yhteisiä kohdepaikkoja, jotka voivat kilpailla sitoutumisesta ja vaikuttaa tutkittujen yhdistelmäparien kokonaistoksisuuteen.
LC50-arvojen ja havaitun kuolleisuuden perusteella valittiin kaksi parasta synergististä terpeeniyhdistelmää, nimittäin karvonin ja limoneenin sekä eukalyptolin ja eudesmolin parit, sekä synteettinen organofosforimalationi terpeenien kanssa. Malationi- ja eudesmoliyhdisteiden optimaalista synergististä yhdistelmää testattiin aikuisten hyönteismyrkkyjen biomäärityksessä. Kohdista testit suuriin hyönteisyhdyskuntiin sen varmistamiseksi, voivatko nämä tehokkaat yhdistelmät toimia suuria yksilömääriä vastaan suhteellisen suurilla altistusalueilla. Kaikilla näillä yhdistelmillä on synergistinen vaikutus suuriin hyönteisparviin. Samanlaisia tuloksia saatiin optimaaliselle synergistiselle toukkamyrkkyyhdistelmälle, jota testattiin suuria Aedes aegypti -toukkapopulaatioita vastaan. Voidaan siis sanoa, että tehokas synergistinen toukkamyrkky- ja aikuismyrkkyyhdistelmä kasviperäisistä etyleenioksidiyhdisteistä on vahva ehdokas olemassa olevia synteettisiä kemikaaleja vastaan ja sitä voidaan käyttää edelleen Aedes aegypti -populaatioiden torjuntaan. Samoin tehokkaita synteettisten toukkamyrkkyjen tai aikuismyrkkyjen yhdistelmiä terpeenien kanssa voidaan käyttää myös hyttysille annettavien tymometofossin tai malationin annosten vähentämiseen. Nämä tehokkaat synergistiset yhdistelmät voivat tarjota ratkaisuja tuleviin tutkimuksiin Aedes-hyttysten lääkeresistenssin kehityksestä.
Aedes aegypti -munia kerättiin Intian lääketieteellisen tutkimusneuvoston alueellisesta lääketieteellisestä tutkimuskeskuksesta Dibrugarhista ja säilytettiin kontrolloidussa lämpötilassa (28 ± 1 °C) ja kosteudessa (85 ± 5 %) Gauhati-yliopiston eläintieteen laitoksella seuraavissa olosuhteissa: Arivolit on kuvattu ym. Kuoriutumisen jälkeen toukille ruokittiin toukkien ruokaa (koirankeksijauhetta ja hiivaa suhteessa 3:1) ja aikuisille 10-prosenttista glukoosiliuosta. Kolmantena päivänä esiinmarssin jälkeen aikuisten naarashyttysten annettiin imeä albiinorottien verta. Liota suodatinpaperia vedessä lasissa ja aseta se munintahäkkiin.
Valittuja kasvinäytteitä, nimittäin eukalyptuksen lehtiä (Myrtaceae), pyhää basilikaa (Lamiaceae), minttua (Lamiaceae), melaleucaa (Myrtaceae) ja allium-sipuleita (Amaryllidaceae). Kerätty Guwahatista ja tunnistettu Gauhatin yliopiston kasvitieteen laitoksella. Kerätyt kasvinäytteet (500 g) tislattiin vesiliukoisesti Clevenger-laitteella 6 tunnin ajan. Uutettu etyyliasetaatti kerättiin puhtaisiin lasipulloihin ja säilytettiin 4 °C:ssa jatkotutkimuksia varten.
Toukkien tappavaa myrkyllisyyttä tutkittiin käyttämällä hieman muunneltuja Maailman terveysjärjestön (WHO) standardimenetelmiä 67. Emulgointiaineena käytettiin DMSO:ta. Kutakin EO-pitoisuutta testattiin aluksi 100 ja 1000 ppm:n pitoisuuksina, jolloin 20 toukkaa altistettiin kussakin toistokokeessa. Tulosten perusteella sovellettiin pitoisuusaluetta ja kuolleisuus kirjattiin 1 tunnista 6 tuntiin (1 tunnin välein) sekä 24, 48 ja 72 tuntia käsittelyn jälkeen. Subletaalit pitoisuudet (LC50) määritettiin 24, 48 ja 72 tunnin altistuksen jälkeen. Jokainen pitoisuus analysoitiin kolmena rinnakkaisnäytteenä yhdessä yhden negatiivisen kontrollin (vain vesi) ja yhden positiivisen kontrollin (DMSO-käsitelty vesi) kanssa. Jos koteloitumista tapahtuu ja yli 10 % kontrolliryhmän toukista kuolee, koe toistetaan. Jos kontrolliryhmän kuolleisuus on 5–10 %, käytetään Abbottin korjauskaavaa 68.
Ramar et al.69 kuvailemaa menetelmää käytettiin aikuisten biomäärityksessä Aedes aegypti -hyttysiä vastaan asetonia liuottimena käyttäen. Jokaista etyleeniglykolia testattiin aluksi aikuisia Aedes aegypti -hyttysiä vastaan pitoisuuksina 100 ja 1000 ppm. Levitä 2 ml kutakin valmistettua liuosta Whatman-lukuun. Yksi suodatinpaperipala (koko 12 x 15 cm2) ja anna asetonin haihtua 10 minuuttia. Kontrollina käytettiin suodatinpaperia, johon oli lisätty vain 2 ml asetonia. Kun asetoni on haihtunut, käsitelty suodatinpaperi ja kontrollisuodatinpaperi asetetaan sylinterimäiseen putkeen (10 cm syvä). Kymmenen 3–4 päivän ikäistä verta syömätöntä hyttystä siirrettiin kolmena näytteenä kutakin pitoisuutta. Alustavien testien tulosten perusteella testattiin valittujen öljyjen eri pitoisuuksia. Kuolleisuus kirjattiin 1 tunnin, 2 tunnin, 3 tunnin, 4 tunnin, 5 tunnin, 6 tunnin, 24 tunnin, 48 tunnin ja 72 tunnin kuluttua hyttysten vapauttamisesta. Laske LC50-arvot 24 tunnin, 48 tunnin ja 72 tunnin altistusajoille. Jos kontrolliryhmän kuolleisuus ylittää 20 %, toista koko testi. Vastaavasti, jos kontrolliryhmän kuolleisuus on yli 5 %, säädä käsiteltyjen näytteiden tuloksia Abbottin kaavalla68.
Valittujen eteeristen öljyjen ainesosien analysointi suoritettiin kaasukromatografialla (Agilent 7890A) ja massaspektrometrialla (Accu TOF GCv, Jeol). Kaasukromatografi oli varustettu FID-detektorilla ja kapillaarikolonnilla (HP5-MS). Kantajakaasuna oli helium, virtausnopeus oli 1 ml/min. GC-ohjelma asettaa Allium sativumin arvoihin 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M ja Ocimum Sainttumin arvoihin 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, mintun arvoihin 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, eukalyptuksen arvoihin 20.60-1M-10-200-3M-30-280 ja punaisen arvoihin 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M. Tuhannen kerroksen ajan ne ovat ne 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Kunkin EO:n pääyhdisteet tunnistettiin GC-kromatogrammista ja massaspektrometriatuloksista lasketun pinta-alaprosentin perusteella (viitaten NIST 70 -standarditietokantaan).
Kunkin etyleenioksidin kaksi pääyhdistettä valittiin GC-MS-tulosten perusteella ja ostettiin Sigma-Aldrichilta 98–99 %:n puhtausasteella jatkotutkimuksia varten. Yhdisteiden toukkamyrkkyä ja aikuisten toukkamyrkkyä Aedes aegypti -sientä vastaan testattiin edellä kuvatulla tavalla. Yleisimmin käytettyjä synteettisiä toukkamyrkkyjä tamefosaattia (Sigma Aldrich) ja aikuisten toukkamyrkkyä malationia (Sigma Aldrich) analysoitiin niiden tehokkuuden vertaamiseksi valittuihin etyleenioksidiyhdisteisiin samaa menettelyä noudattaen.
Valittujen terpeeniyhdisteiden ja terpeeniyhdisteiden sekä kaupallisten organofosfaattien (tilefossi ja malationi) binääriseokset valmistettiin sekoittamalla kunkin kandidaattiyhdisteen LC50-annos suhteessa 1:1. Valmistetut yhdistelmät testattiin Aedes aegypti -sienen toukka- ja aikuisvaiheissa edellä kuvatulla tavalla. Jokainen biomääritys suoritettiin kolmena rinnakkaismäärityksenä kullekin yhdistelmälle ja kolmena rinnakkaismäärityksenä kussakin yhdistelmässä esiintyville yksittäisille yhdisteille. Kohdehyönteisten kuolema kirjattiin 24 tunnin kuluttua. Laske odotettu kuolleisuus binääriseokselle seuraavalla kaavalla.
jossa E = Aedes aegypti -hyttysten odotettu kuolleisuus binääriyhdistelmän eli yhteyden (A + B) seurauksena.
Kunkin binääriseoksen vaikutus merkittiin synergistiseksi, antagonistiseksi tai ei vaikutukseksi Pavlan52 kuvaamalla menetelmällä lasketun χ2-arvon perusteella. Laske kunkin yhdistelmän χ2-arvo seuraavalla kaavalla.
Yhdistelmän vaikutus määriteltiin synergistiseksi, kun laskettu χ2-arvo oli suurempi kuin vastaavien vapausasteiden taulukkoarvo (95 %:n luottamusväli) ja jos havaitun kuolleisuuden todettiin ylittävän odotetun kuolleisuuden. Vastaavasti, jos minkä tahansa yhdistelmän laskettu χ2-arvo ylittää taulukkoarvon joillakin vapausasteilla, mutta havaittu kuolleisuus on pienempi kuin odotettu kuolleisuus, hoitoa pidetään antagonistisena. Ja jos missä tahansa yhdistelmässä laskettu χ2-arvo on pienempi kuin vastaavien vapausasteiden taulukkoarvo, yhdistelmällä ei katsota olevan vaikutusta.
Kolme tai neljä potentiaalisesti synergististä yhdistelmää (100 toukkaa ja 50 toukkia tappavaa ja aikuisia hyönteisiä tappavaa aktiivisuutta) valittiin testattavaksi suurta hyönteismäärää vastaan. Aikuiset) etenivät kuten edellä. Seosten lisäksi valittujen seosten yksittäisiä yhdisteitä testattiin myös yhtä suurella määrällä Aedes aegypti -toukkia ja aikuisia. Yhdistelmäsuhde on yksi osa LC50-annosta yhtä kandidaattiyhdistettä ja osa LC50-annosta toista ainesosayhdistettä. Aikuisten aktiivisuutta mittaavassa biomäärityksessä valitut yhdisteet liuotettiin asetoniliuokseen ja levitettiin suodatinpaperille, joka oli kääritty 1300 cm3:n lieriömäiseen muovisäiliöön. Asetonia haihdutettiin 10 minuuttia, ja aikuiset vapautettiin. Vastaavasti toukkia tappavassa biomäärityksessä LC50-kandidaatteja liuotettiin ensin yhtä suuriin tilavuuksiin DMSO:ta ja sekoitettiin sitten 1 litran kanssa vettä, jota säilytettiin 1300 cm3:n muovisäiliöissä, ja toukat vapautettiin.
LC50-arvot laskettiin SPSS-ohjelmistolla (versio 16) ja Minitab-ohjelmistolla, ja 71 kirjatun kuolleisuustiedon todennäköisyysanalyysi tehtiin.
Julkaisun aika: 01.07.2024