Tehokkaastitorjua hyttysiäja vähentämään niiden kantamien tautien esiintyvyyttä, tarvitaan strategisia, kestäviä ja ympäristöystävällisiä vaihtoehtoja kemiallisille torjunta-aineille. Arvioimme tiettyjen Brassicaceae-kasvien (Brassica-heimo) siemenjauhoja kasviperäisten isotiosyanaattien lähteenä, joita tuotetaan biologisesti inaktiivisten glukosinolaattien entsymaattisella hydrolyysillä, käytettäväksi egyptiläisen Aedes-kasvin (L., 1762) torjunnassa. Viisi kertaa rasvaton siemenjauho (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 ja Thlaspi arvense – kolme päätyyppiä lämpöinaktivaatiota ja entsymaattista hajoamista Kemialliset tuotteet Allyyli-isotiosyanaatin, bentsyyli-isotiosyanaatin ja 4-hydroksibentsyyli-isotiosyanaatin myrkyllisyyden (LC50) määrittämiseksi Aedes aegypti -toukille 24 tunnin altistuksella = 0,04 g/120 ml dH2O). Sinapin, valkosinapin ja peltokortteen LC50-arvot olivat vastaavasti 0,05, 0,08 ja 0,05, kun taas allyyli-isotiosyanaatti (LC50 = 19,35 ppm) ja 4-hydroksibentsyyli-isotiosyanaatti (LC50 = 55,41 ppm) olivat toukille myrkyllisempiä 24 tuntia käsittelyn jälkeen kuin 0,1 g/120 ml dH2O. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia sinimailasen siemenjauhon tuotannon kanssa. Bentsyyliestereiden korkeampi tehokkuus vastaa laskettuja LC50-arvoja. Siemenjauhon käyttö voi tarjota tehokkaan hyttysten torjuntamenetelmän. Tulos osoittaa, kuinka ristikukkaisten siemenjauheen ja sen tärkeimpien kemiallisten komponenttien tehokkuutta hyttysten toukkia vastaan ja osoittaa, kuinka ristikukkaisten siemenjauheen luonnolliset yhdisteet voivat toimia lupaavana ympäristöystävällisenä toukkamyrkkynä hyttysten torjunnassa.
Aedes-hyttysten aiheuttamat vektorivälitteiset taudit ovat edelleen merkittävä maailmanlaajuinen kansanterveysongelma. Hyttysten levittämien tautien esiintyvyys leviää maantieteellisesti1,2,3 ja ilmaantuu uudelleen, mikä johtaa vakavien tautiepidemioihin4,5,6,7. Tautien leviäminen ihmisten ja eläinten keskuudessa (esim. chikungunya, denguekuume, Rift Valley -kuume, keltakuume ja Zika-virus) on ennennäkemätöntä. Pelkästään denguekuume asettaa noin 3,6 miljardia ihmistä tartuntariskiin tropiikissa, ja arviolta 390 miljoonaa tartuntaa tapahtuu vuosittain, mikä johtaa 6 100–24 300 kuolemaan vuodessa8. Zika-viruksen uudelleen ilmaantuminen ja puhkeaminen Etelä-Amerikassa on herättänyt maailmanlaajuista huomiota sen aiheuttamien aivovaurioiden vuoksi tartunnan saaneille naisille syntyneille lapsille2. Kremer ym.3 ennustavat, että Aedes-hyttysten maantieteellinen levinneisyysalue jatkaa laajentumistaan ja että vuoteen 2050 mennessä puolet maailman väestöstä on vaarassa saada hyttysten levittämien arbovirusten aiheuttaman tartunnan.
Lukuun ottamatta hiljattain kehitettyjä dengue- ja keltakuumerokotteita, useimpia hyttysten levittämiä tauteja vastaan ei ole vielä kehitetty rokotteita9,10,11. Rokotteita on edelleen saatavilla rajoitetusti, ja niitä käytetään vain kliinisissä tutkimuksissa. Hyttysten levittäjien torjunta synteettisillä hyönteismyrkkyillä on ollut keskeinen strategia hyttysten levittämien tautien leviämisen hillitsemiseksi12,13. Vaikka synteettiset torjunta-aineet tappavat hyttysiä tehokkaasti, synteettisten torjunta-aineiden jatkuva käyttö vaikuttaa kielteisesti muihin kuin kohde-eliöihin ja saastuttaa ympäristöä14,15,16. Vielä hälyttävämpää on hyttysten vastustuskyvyn lisääntyminen kemiallisille hyönteismyrkkyille17,18,19. Nämä torjunta-aineisiin liittyvät ongelmat ovat kiihdyttäneet tehokkaiden ja ympäristöystävällisten vaihtoehtojen etsintää tautivektorien torjumiseksi.
Erilaisia kasveja on kehitetty tuholaistorjunta-aineiden lähteiksi20,21. Kasviaineet ovat yleensä ympäristöystävällisiä, koska ne ovat biohajoavia ja niillä on alhainen tai merkityksetön myrkyllisyys muille kuin kohde-eliöille, kuten nisäkkäille, kaloille ja sammakkoeläimille20,22. Yrttivalmisteiden tiedetään tuottavan erilaisia bioaktiivisia yhdisteitä, joilla on erilaiset vaikutusmekanismit hyttysten tehokkaaseen torjuntaan eri elämänvaiheissa23,24,25,26. Kasviperäiset yhdisteet, kuten eteeriset öljyt ja muut aktiiviset kasviainesosat, ovat herättäneet huomiota ja tasoittaneet tietä innovatiivisille työkaluille hyttysten vektorien torjumiseksi. Eteeriset öljyt, monoterpeenit ja seskviterpeenit toimivat karkotteina, ruokailun pelottimina ja munanhimoa estävinä aineina27,28,29,30,31,32,33. Monet kasviöljyt aiheuttavat hyttysten toukkien, koteloiden ja aikuisten kuoleman34,35,36, vaikuttaen hyönteisten hermosto-, hengitys-, umpieritys- ja muihin tärkeisiin järjestelmiin37.
Viimeaikaiset tutkimukset ovat antaneet tietoa sinappikasvien ja niiden siementen mahdollisesta käytöstä bioaktiivisten yhdisteiden lähteenä. Sinappijauhoa on testattu biofumiganttina38,39,40,41 ja sitä on käytetty maanparannusaineena rikkakasvien torjuntaan42,43,44 ja maaperässä leviävien kasvipatogeenien45,46,47,48,49,50, kasvien ravitsemukseen, sukkulamatojen41,51, 52, 53, 54 ja tuholaisten55, 56, 57, 58, 59, 60 torjuntaan. Näiden siemenjauheiden fungisidinen vaikutus johtuu kasvinsuojeluaineista, joita kutsutaan isotiosyanaateiksi38,42,60. Kasveissa nämä suojaavat yhdisteet varastoituvat kasvisoluihin ei-bioaktiivisten glukosinolaattien muodossa. Kun kasvit kuitenkin vaurioituvat hyönteisten syönnin tai patogeenitartunnan seurauksena, myrosinaasi hydrolysoi glukosinolaatit bioaktiivisiksi isotiosyanaateiksi55,61. Isotiosyanaatit ovat haihtuvia yhdisteitä, joiden tiedetään omaavan laajakirjoisen antimikrobisen ja hyönteismyrkkyvaikutuksen, ja niiden rakenne, biologinen aktiivisuus ja pitoisuus vaihtelevat suuresti Brassicaceae-lajien välillä42,59,62,63.
Vaikka sinapinsiemenjauhosta peräisin olevien isotiosyanaattien tiedetään omaavan hyönteismyrkkyä, tiedot niiden biologisesta aktiivisuudesta lääketieteellisesti tärkeitä niveljalkaisia vastaan puuttuvat. Tutkimuksessamme tutkittiin neljän rasvattoman siemenjauheen toukkia tappavaa vaikutusta Aedes-hyttysiä vastaan. Aedes aegypti -hyttysten toukat. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida niiden mahdollista käyttöä ympäristöystävällisinä biotorjunta-aineina hyttysten torjunnassa. Kolmea siemenjauhon pääasiallista kemiallista komponenttia, allyyli-isotiosyanaattia (AITC), bentsyyli-isotiosyanaattia (BITC) ja 4-hydroksibentsyyli-isotiosyanaattia (4-HBITC), testattiin myös näiden kemiallisten komponenttien biologisen aktiivisuuden testaamiseksi hyttysen toukkiin. Tämä on ensimmäinen raportti, jossa arvioidaan neljän kaalinsiemenjauheen ja niiden tärkeimpien kemiallisten komponenttien tehokkuutta hyttysen toukkia vastaan.
Aedes aegypti (Rockefeller-kanta) -laboratorioyhdyskuntia pidettiin 26 °C:ssa, 70 %:n suhteellisessa kosteudessa (RH) ja 10:14 tunnin valojaksolla (L:D). Paritetut naaraat pidettiin muovihäkeissä (korkeus 11 cm ja halkaisija 9,5 cm) ja niitä ruokittiin pulloruokintajärjestelmän kautta sitraattikäsitellyllä naudan verellä (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). Verenruokinta suoritettiin tavalliseen tapaan käyttämällä kalvoista monilasiruokintalaitetta (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA), joka oli yhdistetty kiertovesihauteeseen (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) ja jonka lämpötila oli 37 °C. Venytä Parafilm M -kalvo jokaisen lasisen ruokintakammion pohjalle (pinta-ala 154 mm2). Jokainen ruokintalaite asetettiin sitten parittelua suorittavan naaraan sisältävän häkin peittävälle yläritilälle. Noin 350–400 μl naudan verta lisättiin lasiseen syöttösuppiloon Pasteur-pipetillä (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), ja aikuisten matojen annettiin valua vähintään tunnin ajan. Tiineille naaraille annettiin sitten 10-prosenttista sakkaroosiliuosta, ja niiden annettiin munia kostealle suodatinpaperille, joka oli vuorattu yksittäisiin erittäin kirkkaisiin suflee-kuppeihin (1,25 fl oz:n kokoinen, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Häkki täytettiin vedellä. Aseta munat sisältävä suodatinpaperi suljettuun pussiin (SC Johnsons, Racine, WI) ja säilytä 26 °C:ssa. Munat kuoriutuivat ja noin 200–250 toukkaa kasvatettiin muovialustoilla, jotka sisälsivät kaninruokaa (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) ja maksajauhetta (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). ja kalafileetä (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Saksa) suhteessa 2:1:1. Biomäärityksissämme käytettiin myöhäisen kolmannen asteen toukkia.
Tässä tutkimuksessa käytetty kasvien siemenmateriaali hankittiin seuraavista kaupallisista ja viranomaislähteistä: Brassica juncea (ruskea sinappi-Pacific Gold) ja Brassica juncea (valkosinappi-Ida Gold) Pacific Northwest Farmers' Cooperativelta, Washingtonin osavaltio, Yhdysvallat; (puutarhakrassi) Kelly Seed and Hardware Co.:lta, Peoria, IL, Yhdysvallat ja Thlaspi arvense (peltopennycress-Elisabeth) USDA-ARS:lta, Peoria, IL, Yhdysvallat; Yhtäkään tutkimuksessa käytetyistä siemenistä ei ollut käsitelty torjunta-aineilla. Kaikki siemenmateriaali käsiteltiin ja käytettiin tässä tutkimuksessa paikallisten ja kansallisten määräysten mukaisesti ja kaikkia asiaankuuluvia paikallisia, osavaltion ja kansallisia määräyksiä noudattaen. Tässä tutkimuksessa ei tutkittu transgeenisiä kasvilajikkeita.
Brassica juncea (PG), alfalfa (Ls), valkosinappi (IG) ja peltokortteen (DFP) siemenet jauhettiin hienoksi jauheeksi Retsch ZM200 -ultrakentrifugimyllyllä (Retsch, Haan, Saksa), jossa oli 0,75 mm:n silmäkoko ja ruostumattomasta teräksestä valmistettu roottori, 12 hammasta, 10 000 rpm (taulukko 1). Jauhettu siemenjauhe siirrettiin paperihylsyyn ja rasva poistettiin heksaanilla Soxhlet-laitteessa 24 tunnin ajan. Rasvatonta peltosinappia lämpökäsiteltiin 100 °C:ssa 1 tunnin ajan myrosinaasin denaturoimiseksi ja glukosinolaattien hydrolyysin estämiseksi biologisesti aktiivisten isotiosyanaattien muodostamiseksi. Lämpökäsiteltyä peltokortteen siemenjauhetta (DFP-HT) käytettiin negatiivisena kontrollina denaturoimalla myrosinaasia.
Rasvattomasta siemenjauhosta valmistetu glukosinolaattipitoisuus määritettiin kolmena rinnakkaisnäytteenä käyttäen korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) aiemmin julkaistun protokollan 64 mukaisesti. Lyhyesti sanottuna 3 ml metanolia lisättiin 250 mg:n näytteeseen rasvatonta siemenjauhetta. Kutakin näytettä sonikoitiin vesihauteessa 30 minuuttia ja jätettiin pimeään 23 °C:seen 16 tunniksi. Sitten 1 ml:n näyte orgaanisesta kerroksesta suodatettiin 0,45 μm:n suodattimen läpi automaattiseen näytteenottimeen. Siemenjauhon glukosinolaattipitoisuus määritettiin kolmena rinnakkaisnäytteenä käyttäen Shimadzu LC Solution -ohjelmistoversiota 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). Kolonni oli C18 Inertsil -käänteisfaasikolonni (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, USA). Liikkuvan faasin alkuolosuhteet asetettiin 12 % metanolia / 88 % 0,01 M tetrabutyyliammoniumhydroksidia vedessä (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) virtausnopeudella 1 ml/min. 15 μl:n näytteen injektoinnin jälkeen alkuolosuhteita ylläpidettiin 20 minuuttia, ja sitten liuotinsuhde säädettiin 100 %:iin metanolia, näytteen kokonaisanalyysiajan ollessa 65 minuuttia. Standardikäyrä (nM/mAb-pohjainen) luotiin sarjalaimennoksilla tuoreista sinapiini-, glukosinolaatti- ja myrosiinistandardista (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) rasvattoman siemenjauhon rikkipitoisuuden arvioimiseksi. Näytteiden glukosinolaattipitoisuudet testattiin Agilent 1100 HPLC -laitteella (Agilent, Santa Clara, CA, USA) käyttäen OpenLAB CDS ChemStation -versiota (C.01.07 SR2 [255]), joka oli varustettu samalla kolonnilla ja aiemmin kuvatulla menetelmällä. Glukosinolaattipitoisuudet määritettiin; tulokset olivat vertailukelpoisia HPLC-järjestelmien välillä.
Allyyli-isotiosyanaatti (94 %, stabiili) ja bentsyyli-isotiosyanaatti (98 %) hankittiin Fisher Scientificiltä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-hydroksibentsyyli-isotiosyanaatti hankittiin ChemCruzilta (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Kun myrosinaasilla hydrolysoidaan entsymaattisesti glukosinolaatit, glukosinolaatit ja glukosinolaatit, ne muodostavat vastaavasti allyyli-isotiosyanaatin, bentsyyli-isotiosyanaatin ja 4-hydroksibentsyyli-isotiosyanaatin.
Laboratoriossa tehdyt biomääritykset tehtiin Muturi et al. 32:n menetelmän mukaisesti, muutoksin. Tutkimuksessa käytettiin viittä vähärasvaista siemenrehua: DFP, DFP-HT, IG, PG ja Ls. Kaksikymmentä toukkaa asetettiin 400 ml:n kertakäyttöiseen kolmitielasiin (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA), joka sisälsi 120 ml deionisoitua vettä (dH2O). Hyttysen toukkien myrkyllisyyttä testattiin seitsemällä siemenjauhopitoisuudella: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 ja 0,12 g siemenjauhoa/120 ml dH2O DFP-siemenjauholle, DFP-HT:lle, IG:lle ja PG:lle. Alustavat biomääritykset osoittavat, että rasvaton Ls-siemenjauho on myrkyllisempää kuin neljä muuta testattua siemenjauhoa. Siksi säädimme seitsemän Ls-siemenjauhon käsittelypitoisuutta seuraaviin pitoisuuksiin: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 ja 0,075 g/120 ml dH2O.
Käsittelemätön kontrolliryhmä (dH20, ei siemenjauholisäravinnetta) otettiin mukaan normaalin hyönteiskuolleisuuden arvioimiseksi määritysolosuhteissa. Kunkin siemenjauhon toksikologisiin biomäärityksiin sisältyi kolme rinnakkaista kolmivinkulmaista dekantterilasia (20 myöhäisen kolmannen vaiheen toukkaa dekantterilasia kohden), yhteensä 108 injektiopulloa. Käsiteltyjä astioita säilytettiin huoneenlämmössä (20–21 °C) ja toukkien kuolleisuus rekisteröitiin 24 ja 72 tunnin jatkuvan altistuksen aikana käsittelypitoisuuksille. Jos hyttysen ruumis ja raajat eivät liiku, kun niitä lävistetään tai kosketetaan ohuella ruostumattomasta teräksestä valmistetulla lastalla, hyttysen toukkia pidetään kuolleina. Kuolleet toukat pysyvät yleensä liikkumattomina selkä- tai vatsapuolella astian pohjalla tai veden pinnalla. Koe toistettiin kolme kertaa eri päivinä käyttäen eri toukkaryhmiä, jolloin yhteensä 180 toukkaa altistettiin kullekin käsittelypitoisuudelle.
AITC:n, BITC:n ja 4-HBITC:n myrkyllisyyttä hyttysten toukille arvioitiin käyttämällä samaa biomääritysmenetelmää, mutta eri käsittelyillä. Valmista 100 000 ppm:n kantaliuokset kullekin kemikaalille lisäämällä 100 µl kemikaalia 900 µl:aan absoluuttista etanolia 2 ml:n sentrifugiputkessa ja ravistamalla 30 sekuntia, jotta seos sekoittuu perusteellisesti. Käsittelypitoisuudet määritettiin alustavien biomääritysten perusteella, joissa BITC:n havaittiin olevan paljon myrkyllisempää kuin AITC ja 4-HBITC. Myrkyllisyyden määrittämiseksi käytettiin viittä BITC-pitoisuutta (1, 3, 6, 9 ja 12 ppm), seitsemää AITC-pitoisuutta (5, 10, 15, 20, 25, 30 ja 35 ppm) ja kuutta 4-HBITC-pitoisuutta (15, 15, 20, 25, 30 ja 35 ppm). 30, 45, 60, 75 ja 90 ppm). Kontrollikokeeseen injektoitiin 108 μl absoluuttista etanolia, joka vastaa kemiallisen käsittelyn enimmäistilavuutta. Biomääritykset toistettiin kuten edellä, jolloin yhteensä 180 toukkaa altistettiin käsittelypitoisuutta kohden. Toukkien kuolleisuus kirjattiin kullekin AITC-, BITC- ja 4-HBITC-pitoisuudelle 24 tunnin jatkuvan altistuksen jälkeen.
65 annoksesta riippuvan kuolleisuustiedon probit-analyysi suoritettiin Polo-ohjelmistolla (Polo Plus, LeOra Software, versio 1.0) 50 %:n letaalipitoisuuden (LC50), 90 %:n letaalipitoisuuden (LC90), kulmakertoimen, letaaliannoskertoimen ja 95 %:n letaalipitoisuuden laskemiseksi. Analyysi perustui letaaliannossuhteiden luottamusväleihin log-muunnetuille pitoisuus- ja annos-kuolleisuuskäyrille. Kuolleisuustiedot perustuvat yhdistettyihin replikaattitietoihin 180 toukasta, jotka altistettiin kullekin käsittelypitoisuudelle. Todennäköisyysanalyysit tehtiin erikseen jokaiselle siemenjauholle ja jokaiselle kemialliselle komponentille. Letaaliannossuhteen 95 %:n luottamusvälin perusteella siemenjauhon ja kemiallisten ainesosien myrkyllisyyttä hyttysen toukille pidettiin merkitsevästi erilaisena, joten luottamusväli, joka sisälsi arvon 1, ei ollut merkitsevästi erilainen, P = 0,0566.
HPLC-tulokset tärkeimpien glukosinolaattien määrittämiseksi rasvattomista siemenjauhoista DFP, IG, PG ja Ls on lueteltu taulukossa 1. Testattujen siemenjauhojen tärkeimmät glukosinolaatit vaihtelivat lukuun ottamatta DFP:tä ja PG:tä, jotka molemmat sisälsivät myrosinaasi-glukosinolaatteja. PG:n myrosiniinipitoisuus oli korkeampi kuin DFP:ssä, 33,3 ± 1,5 ja 26,5 ± 0,9 mg/g. Ls-siemenjauhe sisälsi 36,6 ± 1,2 mg/g glukoglykonia, kun taas IG-siemenjauhe sisälsi 38,0 ± 0,5 mg/g sinapiinia.
Ae. Aedes aegypti -hyttysten toukat kuolivat, kun niitä käsiteltiin rasvattomalla siemenjauheella, vaikka käsittelyn tehokkuus vaihteli kasvilajista riippuen. Vain DFP-NT ei ollut myrkyllinen hyttysen toukille 24 ja 72 tunnin altistuksen jälkeen (taulukko 2). Aktiivisen siemenjauheen myrkyllisyys lisääntyi pitoisuuden kasvaessa (kuva 1A, B). Siemenjauhon myrkyllisyys hyttysen toukille vaihteli merkittävästi LC50-arvojen letaaliannoksen suhteen 95 %:n luottamusvälin perusteella 24 tunnin ja 72 tunnin arvioinneissa (taulukko 3). 24 tunnin kuluttua Ls-siemenjauhon myrkyllinen vaikutus oli suurempi kuin muiden siemenjauhokäsittelyjen, ja sillä oli suurin aktiivisuus ja maksimaalinen myrkyllisyys toukille (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Toukat olivat vähemmän herkkiä DFP:lle 24 tunnin kohdalla verrattuna IG-, Ls- ja PG-siemenjauhekäsittelyihin. LC50-arvot olivat vastaavasti 0,115, 0,04 ja 0,08 g/120 ml dH2O, jotka olivat tilastollisesti korkeammat kuin LC50-arvo 0,211 g/120 ml dH2O (taulukko 3). DFP:n, IG:n, PG:n ja Ls:n LC90-arvot olivat 0,376, 0,275, 0,137 ja 0,074 g/120 ml dH2O (taulukko 2). DPP:n korkein pitoisuus oli 0,12 g/120 ml dH2O. 24 tunnin arvioinnin jälkeen toukkien keskimääräinen kuolleisuus oli vain 12 %, kun taas IG- ja PG-toukkien keskimääräinen kuolleisuus oli 51 % ja 82 %. 24 tunnin arvioinnin jälkeen keskimääräinen toukkien kuolleisuus Ls-siemenjauhokäsittelyn korkeimmalla pitoisuudella (0,075 g/120 ml dH2O) oli 99 % (kuva 1A).
Kuolleisuuskäyrät arvioitiin Ae. Egyptian larvan (3. vaiheen toukat) annosvasteesta (Probit) siemenjauhopitoisuuden suhteen 24 tuntia (A) ja 72 tuntia (B) käsittelyn jälkeen. Katkoviiva edustaa siemenjauhokäsittelyn LC50-arvoa. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Lämpöinaktivoitu Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Tyynenmeren Gold), Ls Lepidium sativum.
72 tunnin arvioinnissa DFP-, IG- ja PG-siemenjauhon LC50-arvot olivat vastaavasti 0,111, 0,085 ja 0,051 g/120 ml dH2O. Lähes kaikki Ls-siemenjauholle altistuneet toukat kuolivat 72 tunnin altistuksen jälkeen, joten kuolleisuustiedot olivat ristiriidassa Probit-analyysin kanssa. Verrattuna muihin siemenjauhoihin toukat olivat vähemmän herkkiä DFP-siemenjauhokäsittelylle ja niillä oli tilastollisesti korkeammat LC50-arvot (taulukot 2 ja 3). 72 tunnin kuluttua DFP-, IG- ja PG-siemenjauhokäsittelyjen LC50-arvoiksi arvioitiin 0,111, 0,085 ja 0,05 g/120 ml dH2O. 72 tunnin arvioinnin jälkeen DFP-, IG- ja PG-siemenjauheiden LC90-arvot olivat vastaavasti 0,215, 0,254 ja 0,138 g/120 ml dH2O. 72 tunnin arvioinnin jälkeen DFP-, IG- ja PG-siemenjauhokäsittelyjen toukkien keskimääräinen kuolleisuus maksimipitoisuudella 0,12 g/120 ml dH2O oli vastaavasti 58 %, 66 % ja 96 % (kuva 1B). 72 tunnin arvioinnin jälkeen PG-siemenjauhon havaittiin olevan myrkyllisempää kuin IG- ja DFP-siemenjauhon.
Synteettiset isotiosyanaatit, allyyli-isotiosyanaatti (AITC), bentsyyli-isotiosyanaatti (BITC) ja 4-hydroksibentsyyli-isotiosyanaatti (4-HBITC), voivat tehokkaasti tappaa hyttysen toukkia. 24 tuntia käsittelyn jälkeen BITC oli toukille myrkyllisempi LC50-arvon ollessa 5,29 ppm verrattuna AITC:n 19,35 ppm:ään ja 4-HBITC:n 55,41 ppm:ään (taulukko 4). Verrattuna AITC:hen ja BITC:hen, 4-HBITC:llä on alhaisempi myrkyllisyys ja korkeampi LC50-arvo. Kahden tärkeimmän isotiosyanaatin (Ls ja PG) myrkyllisyydessä hyttysen toukille on merkittäviä eroja tehokkaimmassa siemenjauhossa. AITC:n, BITC:n ja 4-HBITC:n LC50-arvojen tappavan annoksen suhteeseen perustuva myrkyllisyys osoitti tilastollisen eron siten, että LC50-tappavan annoksen suhteen 95 %:n luottamusväli ei sisältänyt arvoa 1 (P = 0,05, taulukko 4). Sekä BITC:n että AITC:n korkeimpien pitoisuuksien arvioitiin tappavan 100 % testatuista toukista (kuva 2).
Kuolleisuuskäyrät arvioitiin Ae:n annos-vasteesta (Probit). 24 tuntia käsittelyn jälkeen egyptiläistoukat (3. vaiheen toukat) saavuttivat synteettisen isotiosyanaatin pitoisuudet. Katkoviiva edustaa isotiosyanaattikäsittelyn LC50-arvoa. Bentsyyli-isotiosyanaatti BITC, allyyli-isotiosyanaatti AITC ja 4-HBITC.
Kasvien biopestisidien käyttöä hyttysten leviämisen torjunta-aineina on tutkittu jo pitkään. Monet kasvit tuottavat luonnollisia kemikaaleja, joilla on hyönteismyrkkyvaikutus37. Niiden bioaktiiviset yhdisteet tarjoavat houkuttelevan vaihtoehdon synteettisille hyönteismyrkkyille, ja niillä on suuri potentiaali tuholaisten, kuten hyttysten, torjunnassa.
Sinappikasveja viljellään siementensä vuoksi, mausteena ja öljyn lähteenä. Kun sinappiöljyä uutetaan siemenistä tai kun sinappia uutetaan biopolttoaineena käytettäväksi,69 sivutuotteena syntyy rasvatonta siemenjauhoa. Tämä siemenjauho säilyttää monia luonnollisista biokemiallisista komponenteistaan ja hydrolyyttisistä entsyymeistään. Tämän siemenjauhon myrkyllisyyden katsotaan johtuvan isotiosyanaattien tuotannosta55,60,61. Isotiosyanaatteja muodostuu glukosinolaattien hydrolyysissä myrosinaasi-entsyymin avulla siemenjauhon hydraation aikana38,55,70, ja niillä tiedetään olevan fungisidisia, bakteereja tappavia, nematisidisia ja hyönteisiä tappavia vaikutuksia sekä muita ominaisuuksia, kuten kemiallisia aistivaikutuksia ja kemoterapeuttisia ominaisuuksia61,62,70. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että sinappikasvit ja siemenjauho toimivat tehokkaasti fumigantteina maaperän ja varastoitujen elintarvikkeiden tuholaisia vastaan57,59,71,72. Tässä tutkimuksessa arvioimme neljän siemenjauhon ja sen kolmen bioaktiivisen tuotteen AITC:n, BITC:n ja 4-HBITC:n myrkyllisyyttä Aedes-hyttysten toukille. Aedes aegypti. Siemenjauhon lisäämisen suoraan hyttysentoukkia sisältävään veteen odotetaan aktivoivan entsymaattisia prosesseja, jotka tuottavat hyttysentoukille myrkyllisiä isotiosyanaatteja. Tämä biotransformaatio osoitettiin osittain siemenjauhon havaitulla toukkia tappavalla vaikutuksella ja hyönteismyrkkyvaikutuksen menetyksellä, kun kääpiösinappinsiemenjauho lämpökäsiteltiin ennen käyttöä. Lämpökäsittelyn odotetaan tuhoavan glukosinolaatteja aktivoivat hydrolyyttiset entsyymit, estäen siten bioaktiivisten isotiosyanaattien muodostumisen. Tämä on ensimmäinen tutkimus, joka vahvistaa kaalinsiemenjauheen hyttysiä vastaan tehostavat ominaisuudet vesiympäristössä.
Testatuista siemenjauheista vesikrassin siemenjauhe (Ls) oli myrkyllisin ja aiheutti Aedes albopictus -toukkien korkean kuolleisuuden. Aedes aegypti -toukkia käsiteltiin jatkuvasti 24 tunnin ajan. Loput kolme siemenjauhetta (PG, IG ja DFP) olivat aktiivisempia hitaammin, ja ne aiheuttivat silti merkittävää kuolleisuutta 72 tunnin jatkuvan käsittelyn jälkeen. Vain Ls-siemenjauho sisälsi merkittäviä määriä glukosinolaatteja, kun taas PG ja DFP sisälsivät myrosinaasia ja IG glukosinolaattia pääasiallisena glukosinolaattina (taulukko 1). Glukotropaeoliini hydrolysoituu BITC:ksi ja sinalbiini hydrolysoituu 4-HBITC:ksi61,62. Biomääritystuloksemme osoittavat, että sekä Ls-siemenjauho että synteettinen BITC ovat erittäin myrkyllisiä hyttysten toukille. PG- ja DFP-siemenjauhon pääkomponentti on myrosinaasi-glukosinolaatti, joka hydrolysoituu AITC:ksi. AITC tappaa tehokkaasti hyttysten toukkia ja sen LC50-arvo on 19,35 ppm. Verrattuna AITC:hen ja BITC:hen, 4-HBITC-isotiosyanaatti on toukille vähiten myrkyllinen. Vaikka AITC on vähemmän myrkyllinen kuin BITC, niiden LC50-arvot ovat alhaisemmat kuin monien hyttysten toukilla testattujen eteeristen öljyjen32,73,74,75.
Hyttysten toukkia vastaan käytettävä ristikukkaiskasvien siemenjauheemme sisältää yhden pääasiallisen glukosinolaatin, joka muodostaa yli 98–99 % HPLC-määrityksellä määritetyistä glukosinolaateista. Muita glukosinolaatteja havaittiin hyvin pieniä määriä, mutta niiden pitoisuudet olivat alle 0,3 % glukosinolaattien kokonaismäärästä. Vesikrassin (L. sativum) siemenjauhe sisältää sekundaarisia glukosinolaatteja (sinigriiniä), mutta niiden osuus on 1 % glukosinolaattien kokonaismäärästä, ja niiden pitoisuus on silti merkityksetön (noin 0,4 mg/g siemenjauhetta). Vaikka PG ja DFP sisältävät saman pääasiallisen glukosinolaatin (myrosiinin), niiden siemenjauhojen toukkia tappava vaikutus eroaa merkittävästi niiden LC50-arvojen vuoksi. Härmän myrkyllisyys vaihtelee. Aedes aegypti -toukkien esiintyminen voi johtua myrosinaasiaktiivisuuden tai kahden siemenrehun stabiilisuuden eroista. Myrosinaasiaktiivisuus on tärkeässä roolissa hydrolyysituotteiden, kuten isotiosyanaattien, biologisessa hyötyosuudessa Brassicaceae-kasveissa76. Pocockin ym.77 ja Wilkinsonin ym.78 aiemmat raportit ovat osoittaneet, että myrosinaasin aktiivisuuden ja stabiilisuuden muutokset voivat liittyä myös geneettisiin ja ympäristötekijöihin.
Odotettu bioaktiivisen isotiosyanaatin pitoisuus laskettiin kunkin siemenjauhon LC50-arvojen perusteella 24 ja 72 tunnin kuluttua (taulukko 5) vastaavien kemiallisten käsittelyjen vertailua varten. 24 tunnin kuluttua siemenjauhon isotiosyanaatit olivat myrkyllisempiä kuin puhtaat yhdisteet. Isotiosyanaattikäsittelyjen miljoonasosina (ppm) lasketut LC50-arvot olivat alhaisemmat kuin BITC-, AITC- ja 4-HBITC-käsittelyjen LC50-arvot. Havaitsimme toukkien syövän siemenjauhopellettejä (kuva 3A). Tämän seurauksena toukat saattavat altistua myrkyllisille isotiosyanaateille keskittyneemmin syödessään siemenjauhopellettejä. Tämä oli ilmeisintä IG- ja PG-siemenjauhokäsittelyissä 24 tunnin altistuksessa, joissa LC50-pitoisuudet olivat 75 % ja 72 % alhaisemmat kuin puhtaalla AITC- ja 4-HBITC-käsittelyillä. Ls- ja DFP-käsittelyt olivat myrkyllisempiä kuin puhdas isotiosyanaatti, LC50-arvojen ollessa 24 % ja 41 % alhaisemmat. Kontrolliryhmän toukat koteloituivat onnistuneesti (kuva 3B), kun taas useimmat siemenjauhokäsittelyryhmän toukat eivät koteloituneet ja toukkien kehitys viivästyi merkittävästi (kuva 3B, D). Spodopteralitura-heimon toukat liittyvät kasvun hidastumiseen ja kehityksen viivästymiseen79.
Ae. Aedes aegypti -hyttysten toukkia altistettiin jatkuvasti Brassica-siemenjauheelle 24–72 tunnin ajan. (A) Kuolleet toukat, joiden suuosissa oli siemenjauhon hiukkasia (ympyröity); (B) Kontrollikäsittely (dH20 ilman lisättyä siemenjauhoa) osoittaa, että toukat kasvavat normaalisti ja alkavat koteloitua 72 tunnin kuluttua. (C, D) Siemenjauholla käsitellyt toukat; siemenjauhossa oli kehityksessä eroja eivätkä ne koteloituneet.
Emme ole tutkineet isotiosyanaattien toksisten vaikutusten mekanismia hyttysen toukkiin. Aiemmat punaisilla tulimuurahaisilla (Solenopsis invicta) tehdyt tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että glutationi-S-transferaasin (GST) ja esteraasin (EST) esto on isotiosyanaatin bioaktiivisuuden pääasiallinen mekanismi, ja AITC voi myös estää GST:n aktiivisuutta jopa alhaisella aktiivisuudella. punaisia maahantuotuja tulimuurahaisia pieninä pitoisuuksina. Annos on 0,5 µg/ml80. Sitä vastoin AITC estää asetyylikoliiniesteraasia aikuisilla maissikärsäkkäillä (Sitophilus zeamais)81. Samanlaisia tutkimuksia on tehtävä isotiosyanaatin aktiivisuusmekanismin selvittämiseksi hyttysen toukissa.
Käytämme lämpöinaktivoitua DFP-käsittelyä tukeaksemme ehdotusta, jonka mukaan kasviglukosinolaattien hydrolyysi reaktiivisten isotiosyanaattien muodostamiseksi toimii mekanismina hyttysten toukkien torjuntaan sinapinsiemenjauholla. DFP-HT-siemenjauho ei ollut myrkyllinen testatuilla käyttömäärillä. Lafarga ym. 82 raportoivat, että glukosinolaatit ovat herkkiä hajoamiselle korkeissa lämpötiloissa. Lämpökäsittelyn odotetaan myös denaturoivan myrosinaasientsyymiä siemenjauhossa ja estävän glukosinolaattien hydrolyysin reaktiivisten isotiosyanaattien muodostamiseksi. Tämän vahvistivat myös Okunade ym. 75, jotka osoittivat, että myrosinaasi on lämpötilaherkkä, mikä osoitti, että myrosinaasiaktiivisuus inaktivoitui kokonaan, kun sinapin, mustan sinapin ja verejuurta sisältävien siementen siemenet altistettiin yli 80 °C:n lämpötiloille. Nämä mekanismit voivat johtaa lämpökäsitellyn DFP-siemenjauhon hyönteismyrkkyvaikutuksen menetykseen.
Siten sinapinsiemenjauho ja sen kolme tärkeintä isotiosyanaattia ovat myrkyllisiä hyttysten toukille. Ottaen huomioon nämä erot siemenjauhon ja kemiallisten käsittelyjen välillä, siemenjauhon käyttö voi olla tehokas hyttysten torjuntamenetelmä. On tarpeen tunnistaa sopivat formulaatiot ja tehokkaat annostelujärjestelmät siemenjauheiden käytön tehokkuuden ja stabiilisuuden parantamiseksi. Tuloksemme osoittavat sinapinsiemenjauhon potentiaalisen käytön synteettisten torjunta-aineiden vaihtoehtona. Tästä teknologiasta voisi tulla innovatiivinen työkalu hyttysten vektorien torjuntaan. Koska hyttysten toukat viihtyvät vesiympäristöissä ja siemenjauhon glukosinolaatit muuttuvat entsymaattisesti aktiivisiksi isotiosyanaateiksi nesteytyksen seurauksena, sinapinsiemenjauhon käyttö hyttysten saastuttamassa vedessä tarjoaa merkittävän torjuntapotentiaalin. Vaikka isotiosyanaattien toukkia tappava vaikutus vaihtelee (BITC > AITC > 4-HBITC), tarvitaan lisää tutkimusta sen määrittämiseksi, lisääkö siemenjauhon yhdistäminen useiden glukosinolaattien kanssa synergistisesti myrkyllisyyttä. Tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa rasvattoman ristikukkaiskasvien siemenjauhon ja kolmen bioaktiivisen isotiosyanaatin hyttysiä tappavat vaikutukset. Tämän tutkimuksen tulokset ovat uraauurtavia osoittamalla, että rasvaton kaalinsiemenjauho, siemenistä öljyn uuttamisen sivutuote, voi toimia lupaavana toukkien torjunta-aineena hyttysten torjunnassa. Nämä tiedot voivat auttaa kehittämään kasvinsuojeluaineita ja kehittämään niitä edullisiksi, käytännöllisiksi ja ympäristöystävällisiksi biotorjunta-aineiksi.
Tätä tutkimusta varten luodut aineistot ja niistä tehdyt analyysit ovat saatavilla vastaavalta kirjoittajalta kohtuullisesta pyynnöstä. Tutkimuksen lopussa kaikki tutkimuksessa käytetyt materiaalit (hyönteiset ja siemenjauho) tuhottiin.
Julkaisuaika: 29.7.2024